论文摘要
镰刀菌(Fusarium)是重要的植物病原真菌之一,可侵染多种植物引起病害,对农业生产造成了严重的危害。由于该菌具有种类多、易变异、种内生理分化明显等特点,一直以来都是最难鉴定的真菌类群之一。本研究以山西省不同地区由镰刀菌引起的罹病植株为研究对象,并以少数河北、辽宁病株为对比,对罹病植株的镰刀菌进行了分离纯化和鉴定,同时应用EST-SSR.、SRAP、ISSR标记技术对部分代表菌株进行了遗传多样性研究,旨在为镰刀菌的分类鉴定、遗传分化和系统发育等方面提供理论依据。主要研究结果如下：1.自山西省8个地区、22个县市及河北、辽宁部分地区共采集具有典型镰刀菌病害症状的植物病害标本290余份,采用常规组织分离法对其上的镰刀菌进行分离纯化,共分离到镰刀菌单孢菌株784株。经标准化培养后,参考Leslie、Nelson、Booth的分类鉴定依据,共鉴定出分属于11组28种的626株镰刀菌,分别为：尖孢镰刀菌F.oxysporum,芬芳镰刀菌F. redolens,腐皮镰刀菌F. solani,蓝色镰刀菌F coeruleum,轮枝镰刀菌F.verticillioides,层生镰刀菌F. proliferum,胶孢镰刀菌F. subglutinans,潮湿镰刀菌Fudumand,拟枝孢镰刀菌F.sporotrichioides,三线镰刀菌Ftricinctum,迷惑镰刀菌F.illudens,弯角镰刀菌F. camptoceras,腹状镰刀菌F. ventricosum,锐顶镰刀菌F.acuminatum,接骨木镰刀菌蓝色变种F. sambucinum var. coeruleum,接骨木镰刀菌F.sambucinum,大刀镰刀菌F.culmorum,异孢镰刀菌F. heterosporum,水生镰刀菌F.aquaeductuum,节状镰刀菌Fmerismoides,燕麦镰刀菌Favenaceum,厚垣镰刀菌F.chlamydosporum,木贼镰刀菌F. equiseli,禾谷镰刀菌F. graminearum,砖红镰刀菌F.lateritium,半裸镰刀菌F. semitactum,拟丝孢镰刀菌F.trichothecioides和雪腐镰刀菌F.nivale.并列出了分离菌株的分组分种检索表。2.通过利用SSRhunter软件对NCBI已公布的尖孢镰刀菌与轮枝镰刀菌EST序列中的SSR进行搜索,并对搜索到的EST-SSR的组成和丰度进行系统分析,结果表明：(1)在已公布的9304条尖孢镰刀菌EST序列中,共有92个SSR位点,分布于90条EST中,发生频率为1.0%。其中二核苷酸重复类型出现频率最高,占总SSR的59.78%,其次是三核苷酸重复类型,占总SSR的17.39%。在出现的26类重复基序中AG/TC重复基序出现频率最高。(2)从已公布的63875条轮枝镰刀菌EST序列中,共搜索到1147个SSR位点,分布于1112条EST中,发生频率为1.8%。其中优势重复出现类型为三核苷酸重复基序,占总SSR的44.55%,其次是五核苷酸重复类型,占总SSR的24.06%。在出现的163种重复基序中,AGA/TCT和CGACAA重复基序出现频率最高,其次是AAC/GTT、基于两种镰刀菌的EST-SSR,利用Primer premier5.0分别设计尖孢镰刀菌与轮枝镰刀菌EST-SSR引物30对和25对,从中选取能够有效扩增的尖孢镰刀菌引物20对(80.0%),轮枝镰刀菌引物22对(88.0%),检测其在各自种内的多态性及在近缘镰刀菌种中的通用性。结果表明,分别有19对(63.3%)尖孢镰刀菌SSR引物与13对(52.0%)轮枝镰刀菌SSR引物具有多态性。在另外5种近缘镰刀菌种中都能通用的尖孢镰刀菌引物与轮枝镰刀菌引物分别为11对(55.0%)与17对(55.0%),均具有多态性的尖孢镰刀菌与轮枝镰刀菌引物分别为3对(15.0%)、5对(22.7%)。说明基于两种镰刀菌EST序列设计的SSR引物不仅具有较高的多态性频率,而且在近缘镰刀菌种中具有较高的通用率。选取8对在镰刀菌种间具有多态性的EST-SSR引物对分属于6组9种的117株镰刀菌与4株未知菌株进行遗传多样性分析,共扩增出191条条带,多态性比例为100%。聚类分析结果表明,在一定遗传相似系数水平上,同种镰刀菌都聚在同一类群或同一亚类群中,相同寄主来源的同种菌株聚在同一分支。遗传相似性分析结果表明,供试同种镰刀菌种内各菌株间的平均遗传相似系数均高于不同种镰刀菌菌株间的平均遗传相似系数,F. oxysporum和F. verticillioides种内遗传相似系数分布在0.696-0.979,明显比F.coeruleum、F. solani. F. semitectum. F. equiseti、F. graminearum种内的遗传相似系数变幅(0.895-0.990)大。说明基于尖孢镰刀菌与轮枝镰刀菌EST序列设计的SSR引物能将不同组、种和寄主专化型的菌株区分开,但这些引物在尖孢镰刀菌与轮枝镰刀菌种内检测到的遗传分化相对更明显。基于尖孢镰刀菌与轮枝镰刀菌EST序列开发的SSR引物,可用于镰刀菌的遗传多样性分析、分类鉴定等方面的研究,但在近缘种内的多态性水平相对较低。3.利用SRAP分子标记的方法,从随机组合的25对引物中,筛选出12对扩增条带清晰、多态性明显的引物组合,对供试的6组9种镰刀菌进行遗传多样性分析。共扩增出260条谱带,所有条带在不同菌株间均表现为多态性,多态性比例达100%。平均每对引物可扩增10.1条多态性条带。说明这种新型标记用于镰刀菌的遗传多样性分析是切实可行的。聚类分析结果表明,当遗传相似系数为0.814时,所有供试菌株可分为六个类群,每个类群在不同的相似系数下,又可以分为多个亚类群。同种镰刀菌都聚在同一类群或同一亚类群中。可见,基于遗传相似系数对镰刀菌进行的SRAP类群划分与形态学种的划分基本相符。因此,SRAP分子标记可以很好地揭示镰刀菌属不同形态学种间的遗传分化,是进行镰刀菌遗传多样性、分类鉴定、遗传分化等研究的一种十分有效的分子标记方法。SRAP遗传多样性分析结果表明,不同种镰刀菌及同种内不同分离菌株之间均存在明显的遗传分化,且种内各菌株间的遗传分化与寄主和地理来源没有相关性。4.采用ISSR分子标记技术对33株地理来源不同的尖孢镰刀菌进行了遗传多样性分析。结果表明,利用筛选出的11条引物扩增出105条条带,其中多态性条带91条,多态性位点比例为86.7%。遗传相似性与聚类分析结果表明,供试菌株间的遗传相似系数为0.606～0.962,平均0.756,当遗传相似系数为0.962时,供试的33株菌可被全部区分开。可见,尖孢镰刀菌基因组在SSR区域具有丰富的多态性。寄主来源相同的供试菌株间的遗传相似性与其地理来源有一定的相关性。5.三种分子标记的分析结果比较表明,三种标记均适用于镰刀菌的遗传多样性分析,但在检测水平上存在一定差异。基于EST-SSR与SRAP标记对供试镰刀菌划分的遗传多样性类群与镰刀菌形态学种的划分基本一致,但在分析镰刀菌种间遗传多样性上,SRAP比EST-SSR能揭示不同镰刀菌种间更大的遗传差异,更适合于镰刀菌种间的遗传分化研究。用于尖孢镰刀菌种内多样性分析时,与SRAP与EST-SSR相比,ISSR能揭示种内更大的遗传分化,而EST-SSR标记在揭示尖孢镰刀菌种内各菌株间的遗传分化与寄主的相互关系上要优于ISSR。因此,在实际研究工作中要根据具体研究目的和供试菌株,选择其中一种或将EST-SSR、SRAP与ISSR分子标记相结合,才能较全面客观地反映镰刀菌属种间及种内各菌株间的遗传分化与亲缘关系,从而得出较全面、科学的结论。