论文摘要
目的：探讨NGF促进海马神经再生、神经干细胞向神经元和胆碱能神经元分化过程中,POU同源盒基因Brn-4和LIM同源盒基因Lhx8的表达变化,以及海马新生神经元过表达Lhx8后向胆碱能神经元分化的情况。方法：实验一：1.SD大鼠随机分为对照组、切割组、NGF组、NGF联合切割组,每组18只；切割组大鼠切割右侧穹窿海马伞,NGF组大鼠侧脑室注射NGF,NGF联合切割组在切割右侧穹窿海马伞的基础上侧脑室注射NGF；2.分离各组6只SD大鼠海马组织,提取总RNA,合成第一链cDNA, Real-time PCR检测Brn-4基因的表达变化；3.分离各组6只大鼠海马组织,提取总蛋白并定量,Western blot检测Brn-4蛋白的表达变化；4.各组6只SD大鼠灌注取脑、冰冻切片后,行Brn-4/BrdU/NeuN免疫荧光检测和Hoechst细胞核标记；5.体外培养海马神经干细胞,分为对照组、正常组(含5%正常海马提取液)、切割组(含5%切割侧海马提取液)、NGF组(含20ng/ml的NGF)、NGF+正常组(含20ng/ml的NGF和5%正常海马提取液)、NGF+切割组(含20ng/ml的NGF和5%切割侧海马提取液),培养7d：6.提取各组细胞的总RNA,合成第一链cDNA, Real-time PCR检测Brn-4基因表达变化；7.提取各组细胞总蛋白,Western blot检测Brn-4蛋白的表达变化；8.免疫荧光检测各组DCX/Brn-4双标神经元数；9.图像处理和统计学分析。实验二：1.SD大鼠随机分为对照组、切割组、NGF组、NGF联合切割组,每组各18只：切割组大鼠切割右侧穹窿海马伞,NGF组大鼠侧脑室注射NGF,NGF联合切割组在切割右侧穹窿海马伞的基础上侧脑室注射NGF；2.分离各组6只海马组织,提取总RNA,合成第一链cDNA, Real-time PCR检测Lhx8基因的表达变化；3.分离各组6只大鼠海马组织,提取总蛋白, Western blot检测Lhx8蛋白的表达变化；4.各组6只SD大鼠灌注取脑、冰冻切片后,行ChAT/Lhx8免疫荧光检测和Hoechst细胞核标记：5.体外培养海马神经干细胞,分为对照组、正常组(含5%正常海马提取液)、切割组(含5%切割侧海马提取液)、NGF组(含50ng/ml的NGF)、NGF+正常组(含50ng/ml的NGF和5%正常海马提取液)、NGF+切割组(含50ng/ml的NGF和5%切割侧海马提取液),培养14d；6.提取各组细胞的总RNA,合成第一链cDNA, Real-time PCR检测Lhx8基因表达变化；7.提取各组细胞总蛋白,Western blot检测Lhx8蛋白的表达变化；8.免疫荧光检测各组ChAT/Lhx8双标神经元数；9.图像处理和统计学分析。实验三：1.体外培养海马新生神经元分为对照组和转染组,分别加入阴性对照慢病毒和Lhx8过表达慢病毒,培养5d；2.提取两组细胞的总RNA,合成第一链cDNA, Real-time PCR检测Lhx8基因表达变化；3.提取两组细胞总蛋白,Western blot检测Lhx8蛋白的表达变化；4.免疫荧光检测两组细胞中EGFP/ChAT/VAChT三标神经元数；5.图像处理和统计学分析。结果：实验一：体内实验：1. Real-time PCR检测结果提示,NGF联合切割组中Brn-4的基因表达量较其他三组明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05)；2.Western blot检测结果提示,NGF组中Brn-4蛋白的表达量较对照组及切割组明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05); NGF联合切割组中Brn-4蛋白表达量较其他三组明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；3.对照组海马齿状回颗粒下层及门区中仅见少量的Brn-4/BrdU/NeuN的三标细胞,切割组和NGF组中Brn-4/BrdU/NeuN三标的阳性细胞较对照组明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；NGF联合切割组中的三标细胞增高更为明显,与其他三组比较差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。体外细胞培养：1. Real-time PCR检测结果提示切割组、NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中Brn-4基因的表达量较对照组及正常组明显增高(P<0.05),而上述四组之间无明显差异；2.Western blot结果提示,切割组、NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中Brn-4蛋白的表达量较对照组及正常组明显增高(P<0.01)；NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中Brn-4蛋白的表达量较切割组明显增高(P<0.05),但三组之间无明显差异；3.切割组、NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中DCX/Brn-4双标的阳性细胞数较对照组及正常组明显增多(P<0.01或P<0.001)；NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中DCX/Brn-4阳性细胞数又较切割组明显增多(P<0.05或P<0.01),而三组之间差异无统计学意义。实验二：体内实验：1. Real-time PCR提示NGF组中Lhx8基因的表达量较正常组和切割组明显增高,差异具有统计学意义(P<0.01); NGF联合切割组中Lhx8基因的表达量明显高于其他各组,差异具有统计学意义(P<0.001)；2.Western blot结果提示切割组、NGF组、NGF联合切割组中Lhx8蛋白的表达量明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)；NGF组和NGF联合切割组中Lhx8蛋白的表达量又高于切割组(P<0.05)；3.对照组海马齿状回颗粒下层和门区中几乎检测不到ChAT/Lhx8双标细胞,切割组齿状回颗粒下层和门区中可检测到少量ChAT/Lhx8双标细胞；NGF组可检测到较多的ChAT/Lhx8双标细胞,与对照组及切割组比较明显增多(P<0.001)；NGF联合切割组中ChAT/Lhx8双标细胞最多、明显高于其他三组(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。体外细胞培养：1.Real-time PCR检测结果提示切割组、NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中Lhx8基因的表达量较对照组及正常组明显增高(P<0.05或P<0.01),NGF+切割组中Lhx8基因的表达量明显高于NGF组OP<0.05);2.Western blot结果提示切割组、NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中Lhx8蛋白的表达量较对照组及正常组明显增高(P<0.05或P<0.01); NGF+切割组中Lhx8蛋白的表达量较切割组明显增高(P<0.05)；6.正常组、切割组、NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中ChAT/Lhx8双标细胞数均较对照组明显增多(P<0.05,P<0.001或P<0.001):NGF+切割组中ChAT/Lhx8双标细胞数又较NGF组明显增多(P<0.05),而与NGF+正常组比较无显著性差异。实验三：1. Real-time PCR结果提示,转染组中Lhx8基因的表达水平较对照组明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05);2.Western blot结果提示,转染组中Lhx8的蛋白表达水平较对照组明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05)；3.对照组和转染组均有细胞表达EGFP以及胆碱能神经元标记物ChAT和VAChT,转染组中ChAT/VAChT双标的胆碱能神经元数目明显多于对照组,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论：1.侧脑室灌注NGF能够提高神经再生海马组织中Brn-4和Lhx8mRNA和蛋白的表达水平,并促进海马NSCs向神经元和胆碱能神经元分化；2.体外细胞培养中,NGF促进海马NSCs向神经元分化过程中Brn-4表达增高,向胆碱能神经元分化过程中Lhx8表达增高；3.海马新生神经元转染Lhx8基因使其过表达,可促进其向胆碱能神经元分化；4.Brn-4和Lhx8高表达与海马神经再生和胆碱能神经再生有关。