论文摘要
背景与目的食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)在我国是最常见的上消化道恶性肿瘤,尤其在河南省,发病率和死亡率都很高。ESCC发生是多基因、多因素、多阶段相互作用的结果,在分子水平涉及多基因及蛋白质的变异,但其确切发病机制尚不清楚,阻碍了该病的有效防治。因此,探索ESCC的发生机制,对有效预防ESCC的发生,降低发病率和死亡率显得尤为重要。目前认为,食管炎可能是ESCC发生的癌前病变条件之一,S100A8和S100A9在多种肿瘤细胞和浸润的免疫细胞中均有表达,具有类似致炎细胞因子的功能,其作用机制十分复杂。S100A8/A9是S100A8和S100A9以钙离子依赖方式形成的异源二聚体,在细胞内、外发挥多种生物学功能。研究发现S100A8/A9在多种肿瘤中高表达,并可发挥抗肿瘤和促肿瘤双重效应。但另有研究显示S100A8/A9在食管鳞癌细胞中表达下调或缺失。提示其在食管鳞癌发生发展过程中的作用有别于其他肿瘤,但其机制尚不清楚。本研究在确定食管鳞癌细胞EC9706不表达S100A8和S100A9的前提下,探讨EC9706细胞中是否表达RAGE (receptor of advanced glycation end)和TLR4(Toll-like receptor4)受体,外源性S100A8/A9是否与细胞内源性RAGE或TLR4受体结合,以及外源性S100A8/A9对EC9706细胞凋亡的影响及其调控机制,为进一步研究S100A8/A9相关的食管鳞癌新的治疗靶点提供实验依据。方法1.培养人食管鳞癌细胞EC9706,分为三组：(1)Blank组：加入转染试齐GenJetTM的空白对照；(2)NC组：转染pcDNA3.1空载质粒的阴性对照；(3)实验组：瞬时共转染S100A8和S100A9真核载体。转染细胞放置37℃、5%CO2培养箱继续培养,用于后续实验。2.转染24h后用抗体将S100A8和S100A9蛋白染色,荧光显微镜估算转染效率。3.通过光学显微镜观察转染后24h、48h和72h的NC组和实验组细胞生长状况,估算细胞减少量。4. TUNEL法检测观察外源性S100A8/A9对EC9706细胞凋亡的影响。5.细胞免疫荧光染色后,通过共聚焦显微镜检测转染48h时RAGE (receptor of advanced glycation end)和TLR4(Toll-like receptor4)的表达,并观察S100A8/A9与RAGE和TLR4受体的共定位表达情况。6. Q RT-PCR法检测瞬时转染后24h、48h和72h EC9706细胞中s100a8和s100a9的mRNA的表达水平,同时检测Erk1/2、Nf-κb p65的mRNA的表达水平,及下游靶基因Bcl-2和p53的mRNA表达水平。7. Western blot检测瞬时转染后24h、48h、72h EC9706细胞中S100A8和S100A9蛋白的表达,ERK1、ERK2和NF-KB P65蛋白的表达,及下游靶基因Bcl-2和P53蛋白的表达。结果1.在人食管鳞癌EC9706细胞中,S100A8和S100A9的表达缺失。2.荧光显微镜估算转染效率约为65%。3.光学显微镜观测结果表明：实验组的细胞数量随着转染时间的增加逐渐减少,实验组细胞减少量约60%,而NC组细胞减少量约10%。4.TUNEL实验结果表明：与NC组相比,实验组细胞随时间增加细胞凋亡程度随之加剧,凋亡的细胞数目明显增多(P<0.05)。5.共聚焦显微镜结果显示,RAGE和TLR4受体在Blank组、NC组和实验组细胞中均有表达,且在实验组细胞内外源性S100A8、A9与RAGE及TLR4均有共定位。6. QRT-PCR检测结果显示：s100a8和s100α9mRNA仅在实验组表达。与NC组和Blank组相比,实验组Erk1/2、Nf-κb p65p53mRNA表达量表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)；实验组Bcl-2mRNA表达量的表达明显下调(P<0.05)。7.Westerb blot结果表明：S100A8和S100A9蛋白仅在实验组表达。与NC组和Blank组相比,实验组ERK1、ERK2、NF-κB P65及P53蛋白表达量随着转染时间的增加显著增加(P<0.05)；而Bcl-2在实验组的表达随着转染时间的增加显著降低(P<0.05)。结论1.EC9706细胞中S100A8和S100A9表达缺失,但可分别表达S100A8/A9蛋白受体RAGE和TLR4,且外源性的S100A8/A9蛋白可与这两种受体结合。2.外源性S100A8/A9可诱导EC9706细胞凋亡,其机制可能是与受体结合后激活ERK1/2和NF-κB信号通路,上调P53表达并下调Bcl-2表达,继而诱导ESCC细胞凋亡。