论文摘要
龋病是口腔常见的发生在牙体硬组织的慢性感染性疾病,通过一系列细菌生物膜聚集,代谢产酸,牙体组织局部脱矿等过程,最终发生组织缺损。变异链球菌(Streptococcus mutans, S mutans)是现今公认的致龋菌,它在物理吸附的基础上,通过表面毒力因子对牙齿表面产生粘附作用,最终不断聚集形成致龋性生物膜。由于生物膜内部对细菌提供一个相对稳定的小生境,因此对生物膜的抑制一直是抗感染类疾病的研究热点。而对变异链球菌致龋生物膜的作用研究,在龋病预防中具有重要意义。以往对于抗变异链球菌生物膜的研究多集中于抗生素类药物研究,但随着临床耐药菌株的增多,人们对生态平衡意识的逐渐增强,因此对于天然抗菌化合物的寻找成为抗菌研究领域的热点。来源于海洋生物的天然化合物就是一个很好的天然药物宝库。海洋来源的小分子具有很强的生物活性,已被证明可以抑制多种革兰氏阴性菌和少量革兰氏阳性菌。因此本研究选择一种海洋生物来源的新型小分子2-氨基咪唑/三唑(2-AI/T),研究其对变异链球菌生物膜的作用,作为药物使用的毒性作用,并对其抗生物膜机制进行初步探讨。本实验分为四个部分：第一部分小分子药物2-AI/T对变异链球菌作用的体外研究本实验中首先将小分子药物倍比稀释,得到药物低浓度梯度,通过与变异链球菌生物膜共培养16h,以结晶紫染色法测定药物对变链的抑制作用,计算药物的IC50值,以其作为后续实验的基础浓度值；并用共聚焦显微镜(CLSM)观察药物干预后16h形成的生物膜。其次,以药物IC50值作为使用浓度,分别通过MTT和CFU计数法测定0-24h生物膜细菌与其表面的浮游细菌的生物活力。第三,配制小分子药物高浓度梯度,以结晶紫染色法测定其对4h内形成的变异链球菌新生生物膜的清除作用。在抑制实验中,随药物浓度的增高对细菌的抑制作用增强,IC50值=75umol/1。在活力实验中发现药物对生物膜细菌24h内有持续的抑制作用,随时间的增长而减弱,而对浮游细菌前10h抑制作用明显,之后随时间的增长,细菌活力急剧升高。在清除实验中,证明大于125umol/1的小分子药物即对新生生物膜有清除作用。第二部分小分子药物2-AI/T的药物毒性研究对于小分子药物的毒性实验研究,首先将小分子药物稀释成低浓度梯度,通过MTT方法验证其对人牙龈成纤维细胞的毒性作用。其次以最大限度给药法对小鼠进行药物灌胃实验,观察14天后,小鼠称重并取血液,尿液进行生化鉴定；处死小鼠之后取小鼠的心脏,肝脏,脾脏,肾脏,肺五种器官行组织学鉴定。结果表明小于100umol/1的药物对人牙龈成纤维细胞无毒性作用,药物高剂量对动物无急性中毒危险性。第三部分小分子药物2-AI/T对变异链球菌作用的体内研究本实验首先通过给6周的BABL/C小鼠牙面定植变异链球菌,并涂抹药物,建立小鼠生物膜模型；以CFU计数法检测定菌后1,3,5天牙面变异链球菌数,来鉴定药物对体内变链生物膜的作用。其次将3周刚断乳的SD大鼠表面定植变异链球菌,并涂抹药物,建立大鼠龋齿摸型。于定菌成功后70天取大鼠牙齿以微计算机断层扫描技术(micro-CT)观察分析,来鉴定药物的防龋作用。结果显示,涂抹1,3,5天药物对口内变异链球菌生物膜有明显抑制作用；小分子药物对延缓龋齿病程有明显作用。第四部分小分子药物2-AI/T抗变异链球菌机制初探本实验采用新型的蛋白质组学技术iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantitation),将提取的细菌蛋白质裂解成小肽段,通过肽段荧光标记,分析标本来源,比较药物处理组与对照组的蛋白差异。结果分析取直接比值大于1.2倍且p<0.05的为差异蛋白,比较control比test的差异蛋白为：共394个点,上调188个,下调206个,其中上调>2.0倍的有16个,下调<0.3的有15个。并且发现其对变异链球菌核糖体代谢通路与精氨酸代谢通路有显著的影响。