论文摘要
阪崎克罗诺杆菌是一种无芽孢的兼性厌氧革兰氏阴性菌,它容易寄生于人和动物的肠道内。现有研究已表明婴幼儿配方奶粉是致婴幼儿、早产儿败血症、脑膜炎以及坏死性结肠炎的主要感染来源渠道,可导致婴幼儿高达40%～80%的死亡率。近年来阪崎克罗诺杆菌已被广泛关注,针对其危害的研究也越来越深入。然而,对其致病机理的探讨目前还非常薄弱。因此,针对阪崎克罗诺杆菌的致病机理的研究将是今后研究的热点,这对于预防和治疗阪崎克罗诺杆菌的感染具有重要意义。为了进一步了解阪崎克罗诺杆菌的致病机理,本研究利用实验室已有43株菌株,通过对SD乳鼠进行活菌灌胃后、统计血液、脑组织中活菌数、以及肠组织与剩余尸体比的数据,来比较不同菌株的毒性大小。结果显示,7、23、36、38、50、52号菌株毒性较高,17、18、22、24、26、27、28、31、32、47、48、49号菌株毒性较低。为了进一步获得毒性因子,本研究结合Box-PCR分型结果,挑选出亲源关系关系较近的36号菌株（高毒菌株）和17号菌株（低毒菌株）,通过二维电泳比较其差异蛋白,从中筛选获得毒性相关因子。通过比较两株菌的二维电泳图谱,共发现108个差异蛋白点。通过质谱鉴定,101个蛋白被成功鉴定。对这些差异蛋白进行相似的数据分析与资料查阅,共发现15个可能与毒力相关的蛋白,他们分别是(iroEL, HtpG, DegP,ClpB, OmpW, Flagellin, TerE, TerZ, TerD, TerX, TerA, VirB4, BipA,以及未知功能蛋白MLBr01669和yxxBOS。在前期的研究工作基础上,选择了三种未知功能蛋白的基因,它们分别是生物膜.相关基因ESA02170、表面蛋白相关基因ESA02516、以及文献报道的毒力相关基因ESA02736,通过基因敲除研究其毒力相关性。根据基因序列设计引物,扩增出含有酶切位点的上下游片段及氯霉素抗性片段,并利用重组DNA技术将三部分连接至pMD18-T,成功构建出高特异性的长片段敲除载体。其中,ESA02170基因的上游片段为672bp、下游片段为615bp,敲除片段全长为2283bp；ESA02516基因基因的上游片段为791bp、下游片段为632bp,敲除片段全长为3508bp；ESA-02736基因的上游片段为661bp、下游片段为652bp,敲除片段全长为2117bp。将含有重组酶基因的敲除载体pKD46电转化至ATCC BAA-894号菌株中,制备了能够表达重组酶的宿主菌株。将敲除片段转入含有pKD46的宿主菌中,通过PCR筛选基因敲除突变株,结果显示氯霉素抗性基因存在于突变株中,但是突变子仍需要进一步验证。本研究的开展,为阪崎克罗诺杆菌致病因子的鉴定以及致病机制的研究奠定了基础。