论文摘要
背景与目的肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内，肺癌的发病率明显升高，在2013年，肺癌估计占所有女性癌症死亡的26％和所有男性癌症死亡的28％，至今，肺癌已成为全世界癌相关性死亡的主要原因。在中国，肺癌的发病率逐年快速上升，在过去的几十年里，肺癌死亡率增加了465%，其死亡率在城市中居首位，在农村中位于第二位。在所有的肺癌中，非小细胞肺癌（Non-small Cell LungCancer，NSCLC）占75-80%。尽管临床和实验肿瘤学均取得了许多新的进展，但是肺癌的预后仍不如人意，5年生存率只有约11%。造成肺癌高死亡率的主要原因是患者确诊时肿瘤细胞已经发生了侵袭和转移，缺乏有效的治疗措施。因此，为了给肺癌患者提供有效的治疗策略，提高肺癌患者的生存率，必须积极寻找有效的早期诊断及预后标志物。全基因组分析表明，人类基因组中编码蛋白的基因不到2%，超过90%的基因被转录为非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）。这些ncRNA从长度上划分可以分为两类：短片段非编码RNA(short ncRNAs)和长片段非编码RNA（longncRNAs，lncRNAs）。lncRNA是一类长度大于200nt的非编码RNA。众所周知，lncRNA在癌症的发生发展中发挥重要作用，其与多种癌症的生物学过程有关，比如癌症的发生发展、浸润和转移过程。虽然基因组分析发现了大量的lncRNAs，但目前只有少部分lncRNAs被广泛用于研究，其中较为突出的是HOTAIR、MALAT-1，自从lncRNAs研究热潮开辟以来，这两个lncRNAs的功能和分子机制已经被广泛研究，肿瘤临床相关研究还发现，这些lncRNAs具有作为肿瘤诊断、预后分子标志物的潜力，其表达水平与多种肿瘤的临床病理特征以及预后相关。反义lncRNAs（NATs, Natural antisense transcripts）是一类从蛋白或非蛋白编码基因的相反链上转录而来的lncRNAs，现研究发现NATs在肿瘤的发生与发展中发挥了重要的作用。AFAP1-AS1是一个首先在Barrett食管和食管腺癌中被发现的lncRNA，是蛋白编码基因AFAP1的NATs，它在Barrett食管和食管腺癌中低甲基化、高表达。随后的实验表明敲低AFAP1-AS1抑制食管腺癌细胞的增殖以及侵袭能力。本实验室的胃癌组织芯片也表明AFAP1-AS1在胃癌组织中高表达。虽然如此，AFAP1-AS1与非小细胞肺癌临床病理特征相关性的研究暂时无报道。因此，本研究通过qRT-PCR方法检测AFAP1-AS1在NSCLC患者肺癌组织及其对应的正常肺组织标本中的表达情况，并对患者的临床病理特征进行分析，揭示AFAP1-AS1在非小细胞肺癌中的可能作用，并探讨AFAP1-AS1与AFAP1在非小细胞肺癌中的潜在关联。方法1.病人与组织样本收集广州军区总医院胸外科2012年12月至2013年12月行根治性或姑息性切除术的65例非小细胞肺癌原发病灶及癌旁组织（癌旁组织距离癌组织达5cm以上），同时收集患者个人信息和详细临床资料。2.细胞株及培养正常肺支气管上皮细胞16HBE和肺癌上皮细胞株A549、H1299、H460以及95-D用RPMI-1640完全培养基在37℃、5%CO2的湿润条件下培养。3.总RNA提取和qRT-PCR分析使用TRIzol isolation reagent按照说明书提取冻存肺癌组织及癌旁正常组织总RNA，将RNA逆转录成cDNA；用qRT-PCR方法在7500荧光定量PCR仪上进行相对定量分析。4.统计分析数据采用SPSS16.0进行统计分析，以α=0.05作为检验水准。配对样本均数间的比较采用配对样本t检验。AFAP1-AS1表达、AFAP1表达与非小细胞肺癌临床病理特征的相关性采用χ2分析。AFAP1-AS1表达水平与AFAP1表达水平的相关性用Spearman相关分析来分析。结果1. AFAP1-AS1在非小细胞肺癌组织以及细胞株中的表达情况在65例非小细胞肺癌患者中，50.8%（33/65）的癌组织中AFAP1-AS1表达水平明显高于对应的正常癌旁组织中的水平（P＜0.05）。同时AFAP1-AS1在肺癌细胞株H1299、H460中均呈高表达。2.非小细胞肺癌中AFAP1-AS1表达与临床病理特征的相关性非小细胞肺癌组织中的AFAP1-AS1的表达水平与非小细胞肺癌的组织学类型有关（P＜0.05），与性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期均无相关性（P＞0.05）3.AFAP1-AS1表达水平与AFAP1表达水平的相关性AFAP1-AS1表达水平与AFAP1表达水平呈显著正相关（r=0.548，P＜0.05），且AFAP1的表达水平与非小细胞肺癌的组织学类型有关（P＜0.05），与性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期均无相关性（P＞0.05）结论1. AFAP1-AS1在非细胞肺癌组织和细胞株中均呈高表达，在癌症的发生过程中可能具有类癌基因的功能，与非小细胞肺癌的发生发展密切相关。2. AFAP1-AS1的表达水平与AFAP1的表达水平在非小细胞肺癌中呈显著正相关。3. AFAP1-AS1、AFAP1的表达水平与非小细胞肺癌的组织分型相关，在腺癌中AFAP1-AS1、AFAP1的表达水平均高于鳞癌等其它组织类型肺癌中的表达，提示AFAP1-AS1与AFAP1的表达水平具有作为NSCLC组织分型标志物的可能性。