论文摘要
目的：通过建立高脂饮食诱导的小鼠单纯性脂肪肝模型及拘束应激小鼠模型，研究嘌呤生物碱theacrine对小鼠肝脏脂肪化的改善作用和对拘束应激小鼠脂代谢紊乱的改善作用，并探讨其相关机制。对theacrine的生物活性评价和作用机制的研究，以期确认theacrine在脂质代谢中的应用价值。材料与方法：论文一：Theacrine激活SirT3/AMPK/ACC信号通路减少高脂饮食小鼠肝脏脂肪化。1.C57BL/6J小鼠高脂喂养17周诱导成单纯性脂肪肝。动物随机分为标准饮食组和高脂饮食组，分别喂养标准饲料和高脂饲料。取体重相近的小鼠随机分为3组，每组8只，组间体重无显著性差异（P>0.05），分别是HF组，theacrine低剂量组（10mg/kg， HF+TL），theacrine高剂量组（20mg/kg，HF+TH）。最后一次给药后，用乙醚麻醉小鼠，迅速取出肝脏。检测肝脏中TG含量；切取约1cm3部分置于4%多聚甲醛中固定后制作石蜡切片用于苏丹IV染色检测组织脂肪蓄积程度。Western blot检测肝脏中SirT3蛋白表达及AMPK、ACC的磷酸化水平。2.取单层培养的HepG2细胞，用胰酶消化，并以每孔4×105个接种于6孔板中。分组培养分为正常对照组；compound C组（15μmol/L compound C）；theacrine组（2mmol/L theacrine）；theacrine+compound C组（15μmol/L compound C+2mmol/L theacrine）。培养24h后收集细胞用于western blot检测SirT3蛋白表达及AMPK、ACC的磷酸化水平。论文二：Theacrine对拘束应激小鼠脂肪酸代谢的影响及机制研究1.实验将小鼠按照体重随机分组：正常对照组，氧化应激组，10mg/kg，20mg/kgtheacrine低高剂量（TL，TH）给药组，每组10只。实验组每天给药1次连续给药7天，除正常对照组外，其余各组给药第7天后拘束应激20h。拘束应激结束30min后，每组取5只小鼠尾静脉注射10%的脂肪乳剂，测定中性脂肪耐量。其余小鼠在拘束应激结束30min后处死取血并取出心脏。试剂盒检测血浆中脂蛋白脂肪酶（lipoprteinlipase，LPL）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量。用Western blot法检测心脏中SirT3蛋白表达及AMPK、ACC的磷酸化水平。用RT-PCR法检测心脏中LPL、GPIHBP1、ANGPTL4的mRNA表达。应用高效液相色谱法测定血浆中皮质酮的含量变化。2.实验动物分组为：氧化应激组，10mg/kg compound C组，20mg/kg theacrine+10mg/kg compound C组，25mg/kg Ru486组，20mg/kg theacrine+25mg/kg Ru486组，每组10只。Theacrine组连续给药7天，应激组与compound C组则给予相同剂量的注射溶剂，在给药第7天compound C单独与联合作用组腹腔给予10mg/kg compound C同时Ru486单独与联合作用组尾静脉给予25mg/kg Ru486后所有动物进行拘束应激，20h后测定相关实验指标。Western blot检测心脏中SirT3蛋白表达及AMPK、ACC的磷酸化水平。RT-PCR检测心脏中脂代谢相关基因的mRNA表达。结果:1. Theacrine激活SirT3/AMPK/ACC信号通路减少高脂饮食小鼠肝脏脂肪化。1.1Theacrine对高脂饮食小鼠肝脏中甘油三酯的影响与标准饮食组小鼠相比，高脂饮食模型组小鼠肝脏中甘油三酯含量明显增加（P<0.01），而theacrine能呈剂量相关地降低高脂饮食小鼠肝脏中甘油三酯的水平（P<0.01）。1.2Theacrine对高脂饮食小鼠肝组织病理学的影响与标准饮食小鼠肝脏的肝小叶结构完整相比，高脂饮食小鼠肝脏的门管区及小叶间静脉周围脂质含量明显多于正常饮食组，出现脂肪变性状态。而高低剂量的theacrine均能减少肝组织中脂肪蓄积。1.3Theacrine对高脂饮食小鼠肝脏中蛋白表达影响与正常组相比，长期高脂饮食导致肝脏脂肪变性下，其肝脏线粒体中SirT3的蛋白表达减少（P<0.05），AMPK的磷酸化水平明显降低（P<0.01），而ACC蛋白的磷酸化也有一定程度的减少。与高脂饮食组相比，theacrine作用组增加了肝脏中SirT3蛋白表达及AMPK和ACC蛋白的磷酸化水平。1.4Theacrine对AMPK抑制后相关蛋白表达的影响在AMPK抑制剂15μmol/L compound C作用后，SirT3的蛋白表达不变，而ACC的磷酸化水平下降。抑制细胞内AMPK的磷酸化后，theacrine仍能激活SirT3，但抑制了ACC的磷酸化作用。2. Theacrine对拘束应激小鼠脂肪酸代谢的影响及机制研究2.1Theacrine对拘束应激小鼠血浆中性脂肪耐受的影响与正常对照组小鼠相比，拘束应激20h小鼠的尾静脉负荷脂肪乳剂后的血浆TG消除速率明显减慢，降低脂肪耐量，10，20mg/kg theacrine均能明显提高氧化应激小鼠血浆TG消除速率。2.2Theacrine对拘束应激小鼠血浆脂蛋白脂肪酶LPL活性的影响拘束应激使小鼠脂肪酸脂肪酶活性下降(P<0.05)，而theacrine给药明显改善因拘束应激降低的小鼠血液中LPL活性。2.3Theacrine对拘束应激小鼠血浆脂质过氧化物水平的影响拘束应激后，与正常组相比，拘束应激后明显增加小鼠血浆的脂质过氧化产物MDA，而theacrine高低剂量作用组可明显改善血浆中MDA含量。2.4Theacrine对拘束应激小鼠血浆超氧化物歧化酶水平的影响与正常组相比，拘束应激后明显降低小鼠血浆中的SOD水平(P<0.01)，theacrine作用后可显著提高体内的超氧化物歧化酶活性水平，明显地缓解机体内的氧化应激状态。2.5Theacrine对拘束应激小鼠相关蛋白表达影响拘束应激模型组小鼠SirT3蛋白表达明显下降，而theacrine高低剂量给药组可明显增加拘束小鼠SirT3蛋白的表达。同时给药之后与模型组相比，p-AMPK的表达明显增多，表明theacrine高低剂量给药组均可明显促进AMPK的磷酸化。2.6Theacrine对拘束应激小鼠基因表达影响与正常组相比，拘束应激后，LPL与GPIHBP1的mRNA的表达并没有明显的变化（P>0.05），给予theacrine后也未发生明显的变化（P>0.05）。而与正常组相比，ANGPTL4的mRNA的水平在拘束应激后则明显的上调（P<0.05），而在theacrine低高剂量作用下，则可明显的逆转了ANGPTL4的mRNA的水平上调（P<0.05，P<0.01）。2.7Theacrine对拘束应激小鼠血浆中皮质酮含量的影响在拘束应激后，小鼠的血浆中皮质酮含量显著增加，而给予theacrine后，能减少血浆中皮质酮水平，并呈剂量依赖关系。theacrine对LPL的激活作用可能与降低血浆皮质酮水平相关。2.8Theacrine对糖皮质激素受体抑制后拘束应激小鼠血浆中LPL、TG清除率、心脏中基因及蛋白的影响给予Ru486作用的小鼠在拘束拘束应激下，其血浆中LPL的水平得到提高（P<0.05），同时增强血浆中TG的清除速率。说明Ru486抑制了皮质酮与糖皮质激素受体结合所产生的下游效应。而给予theacrine能进一步提高血浆LPL的水平及TG清除效率。因此，theacrine对LPL的激活作用可能不与糖皮质激素受体相关。2.9Theacrine对AMPK抑制后拘束应激小鼠血浆中LPL、TG清除率、心脏中基因及蛋白的影响给予compound C作用的小鼠在拘束拘束应激下，其血浆中LPL的水平及TG的清除速率不变，说明AMPK抑制后，LPL的活性变化不大。而给予theacrine同样不能提高血浆LPL的水平及TG清除速率，而SirT3蛋白表达有一定的增加，ANGPTL4的mRNA表达下降。因此，theacrine对LPL的激活作用可能通过SirT3/AMPK介导的下游ANGPTL4的降低，减少LPL的灭活。结论：本研究以高脂诱导的单纯性脂肪肝模型以及拘束应激诱导的氧化应激模型为研究对象，探讨了嘌呤生物碱theacrine对脂肪酸代谢的影响及机制的研究，根据研究结果，结论如下：1. Theacrine可能通过激活SirT3/AMPK/ACC通路减少ACC活性，进而减少脂肪酸合成，抑制肝脏甘油三酯的蓄积，改善高脂饮食小鼠肝脏脂肪化状态。2. Theacrine可以明显增加应激小鼠血浆甘油三酯消除速率和激活血浆中LPL活力，明显地缓解机体内的氧化应激状态，这可能是theacrine改善应激性脂代谢紊乱的原因之一。3. Theacrine对LPL的激活作用可能通过SirT3/AMPK介导的下游ANGPTL4的降低，减少LPL的灭活。4. Theacrine能减少血浆中皮质酮水平，但其对LPL的激活作用可能与皮质酮与糖皮质激素受体的结合无关。