论文摘要
肿瘤的发生和发展与许多信号通路息息相关,因此靶向作用于特定的信号转导分子,从而预防和治疗肿瘤的研究策略日益受到越来越多的关注。在下游生存信号中,PI3K/Akt通路具有十分重要的作用,因此更深入的研究这一通路将会促进开发新颖的肿瘤治疗药物。绵马素PB(aspidin PB)是从香鳞毛蕨Dryopteris fragrans (L.)Schott中分离的一种间苯三酚类化合物,文献报道具有一定的抗肿瘤活性,然而其诱导肿瘤细胞凋亡的机制至今未有深入报道。本文以绵马素PB为研究对象,对其体外抗肿瘤活性和诱导凋亡的机制进行研究,发现绵马素PB通过调节PI3K/Akt/GSK-3β信号通路从而引起HepG2肝癌细胞凋亡。研究结果如下：1.绵马素PB对多种肿瘤细胞株具有良好的增殖抑制作用。其中对HepG2细胞的抑制作用最强,IC50值是10.59±0.67μM,进一步检测结果表明,绵马素PB对HepG2细胞的增殖抑制作用是呈时间和浓度依赖的。然而,正常的小鼠单核巨噬细胞Raw264.7和小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1的IC50值分别是42.50±0.54μM和38.19±0.92μM,远远大于HepG2细胞,说明绵马素PB对正常细胞株的毒性较小。另外,使用激光共聚焦显微镜从形态学角度观察绵马素PB作用于人肝癌HepG2细胞后的变化,可以看出其细胞染色质凝集并固缩,细胞核膜核仁碎裂成小片段形成凋亡小体。2.绵马素PB能够诱导HepG2细胞发生凋亡。首先,使用罗丹明123染色法检测绵马素PB作用于人肝癌HepG2细胞后线粒体跨膜电位的变化,结果呈现明显地下降趋势。其次,采用琼脂糖凝胶电泳检测梯状条带(DNA Ladder)的产生,可以看出加入绵马素PB后的HepG2细胞的泳道内均有明显的DNA Ladder出现。最后,利用AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡百分率,结果显示绵马素PB作用于HepG2细胞48h后,细胞的凋亡百分率显著升高,并且呈浓度依赖的方式。3.绵马素PB通过调节PI3K/Akt/GSK-3β信号通路从而引起HepG2肝癌细胞凋亡(1)绵马素PB可以抑制PI3K的表达,抑制Ser473Akt的磷酸化,抑制Ser9GSK-3β的表达,随后上调NAG-1的表达。相似地,加入PI3K抑制剂渥曼青霉素后,各蛋白的表达效果和绵马素PB作用一致。该结果说明PI3K/Akt/GSK-3β信号通路可能是绵马素PB作用于HepG2肝癌细胞的主要分子机制之一。(2)绵马素PB诱发了caspase-3的激活和PARP的裂解。用广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理HepG2细胞2h后,可明显地抑制二者的变化。这说明绵马素PB诱导的HepG2细胞凋亡是通过caspase所依赖的途径。综上所述,绵马素PB在不影响正常细胞生长的状况下,可以有效地抑制HepG2肝癌细胞的增殖,这种增殖抑制作用与其诱导的细胞凋亡密切相关。绵马素PB通过caspase所依赖的途径诱导HepG2肝癌细胞发生凋亡,其中PI3K/Akt/GSK-3β/NAG-1信号通路可能作为最主要的分子机制之一。上述研究结果将对绵马素PB进一步的研究并开发为新药提供良好的理论基础。