论文摘要
随着蛋白质组学技术和方法研究的深入,蛋白组学研究已由原来的两谱三图三库进一步向蛋白质组深度覆盖和定量研究发展。蛋白质组深度覆盖是蛋白质组注释基因组、发现诊断标志物、药物靶标和关键蛋白质分子的前提和基础,而蛋白质组定量信息的获得有利于蛋白质功能的发现和深度解析。蛋白质组深度覆盖的含义包括蛋白质组中蛋白质鉴定的深度覆盖和蛋白质序列的长度覆盖。随着液相色谱及质谱技术的迅速发展,液相色谱-质谱联用技术已经成为实现蛋白质组深度覆盖和蛋白质组定量的常用手段。然而由于在蛋白质组分析过程中,存在蛋白质样品制备时产生的损耗、样本的不完全酶解、质谱灵敏度低等问题,影响了低丰度蛋白的鉴定,因而限制了蛋白质组覆盖度的提高和更多蛋白定量信息的获取。另外,采用化学合成方法制备内标肽段,价格昂贵、产量低,而体外标记SILAC方法和体内标记iTRAQ或TMT价格昂贵,限制了定量蛋白质组技术的广泛应用。针对蛋白质组学研究中存在的问题,本论文首先在质谱灵敏度方面,研制了一种新型离子源辅助部件,以提高质谱灵敏度与稳健性;其次,针对实际样本酶解不完全问题,研究了通过提高蛋白水解酶的量以增加酶切速度和效率的可行性；最后,针对蛋白质组绝对定量方法中存在的问题,首先基于金属标签的价格低廉的特点,和选择离子监测质谱高灵敏度的特点,发展了一种绝对定量新方法。其次发展了反相色谱填料(C18填料)辅助的18O标记定量肽段串联体蛋白(quantification concatamer, QconCAT)结合液-质联用的蛋白质组绝对定量新方法。本论文由四章组成。第一章概述了蛋白质组学的研究现状、质谱离子源研究现状以及蛋白质酶解效率对蛋白质组研究的影响、金属标记及18O标记结合高效液相色谱-质谱定量方法的最新进展,并在目前研究背景下提出了本课题的研究内容。在第二章,研制了一种离子源辅助部件,不仅提高了目前使用电喷雾离子源的流速,并且增加了灵敏度和喷雾的稳定性。辅助部件设计时,首先通过电动力学方法模拟对影响离子源灵敏度的两个因素进行优化,然后通过制作辅助部件提高了离子化效率及传输效率,进而提高了质谱的灵敏度。首先用多场耦合分析计算软件对离子源辅助部件形状进行设计,之后用标准肽段样品对辅助部件性能进行检验。装有辅助部件的离子源流速设为1-2μL/min后,信号比未使用辅助部件离子源提高了5.6倍,即信噪比增加为原来的2.8倍；定量限比未使用辅助部件纳升源降低65%,且流速保持在在1-2μL/min,增加了质谱分析的稳定性。在第三章,我们将金属标签与选择离子监测技术集合起来,建立了一种蛋白质绝对定量新方法。首先考察了多反应离子监测质谱技术和选择离子监测质谱检测的灵敏度,表明在分析组成简单的样品时选择离子检测质谱技术有更好的灵敏度；其次考察了金属标签用于定量蛋白质组学的可行性,对标记效率、标记歧视性、标记稳定性和金属标记肽段色谱保留行为进行了考察。实验结果表明金属标记可以用于绝对定量。采用建立的蛋白质绝对定量新方法对腾冲嗜热菌蛋白进行定量,结果表明绝对定量方法的灵敏度高,定量限为1fmol;线性范围为1fmol～500finol时,线性范围内R2值大于0.99,具有良好的线性；测定的标准肽段回收率为117.01%,说明该方法具有较高的准确度；将该方法应用于腾冲嗜热菌中烯醇酶蛋白的定量分析,相对标准偏差为5.47%,表明定量结果可信。结果表明该定量方法可以用于蛋白质组绝对定量分析,是简单样本的一种新的方法选择在第四章,我们发展了一种通过增大酶量的蛋白质样本快速、高效酶切方法,并基于这种酶切方法发展了18O标记QconCAT结合液-质联用的目标蛋白质组绝对定量新方法。在溶液状态下,通过增加蛋白酶量至酶与底物质量比为1：1时,可在37℃下2小时内实现对蛋白样品的完全酶切,且未发生自切现象。对酶切后的多肽混合物,通过反相色谱柱分离,实现蛋白酶及酶切肽段的分离,并回收了蛋白酶。进一步通过对回收后的蛋白酶酶切效率进行考察,发现蛋白质的酶切效率没有降低,可重复使用。使用该方法的优点是与一般酶切方法相同,容易掌握,操作简单,酶切时间短、效率高。基于该方法的180标记方法不仅标记时间短,且不产生回标现象。将这种蛋白质酶切方法与18O标记方QconCAT结合液-质联用技术进行整合,建立了一种用于目标蛋白质组绝对定量的分析方法,并对人肝微粒体中的重要药物代谢酶进行了定量分析。