论文摘要
以T-2毒素暴露未出现物质蓄积的染毒对虾各组织匀浆液进行小鼠灌胃。分析小鼠的免疫功能指标、血清生化指标和遗传毒性指标的变化，根据总体概率学分析识别染毒对虾对小鼠的损伤效应。结果显示，染毒对虾对小鼠的免疫功能和遗传特性产生明显损害效应（出现P<0.05的概率高），而小鼠的血清生化指标未出现明显变化（出现P <0.05的概率低），表明染毒对虾具有免疫毒性和遗传毒性，对小鼠造成的肝毒和肾毒损伤效应较小。染毒对虾自身没有T-2毒素的物质蓄积却表现出对小鼠免疫和遗传上的功能蓄积毒性，说明了染毒对虾中可能存在隐蔽态T-2毒素，可通过对虾食物链，对小鼠产生损害效应。不同暴露剂量T-2毒素口服20d蓄积染毒对虾经有机溶剂提取，再采用三氟乙酸水解法处理，通过LC-MS/MS检测处理前后样品中T-2毒素含量，结果证实了对虾体内隐蔽态T-2毒素的存在；明确了对虾中隐蔽态T-2毒素主要集中在对虾的肝胰腺、血液、肌肉、虾头中，且隐蔽态T-2毒素解离率与对虾的暴露剂量呈正相关。肝胰腺为最主要的隐蔽态存在部位，在肝胰腺的上清样中T-2毒素的增量为约为23.6ng/尾，肝胰腺残渣样中解离出的T-2毒素增量约为为11.0ng/尾。残渣样中隐蔽态T-2毒素被解离出，表明有机溶剂分离提取对虾体内的隐蔽态T-2毒素存在一定量的损失。核磁共振和质谱表征，证明了目标T-2毒素母核半抗原3-Ac-NEOS的合成，利用红细胞酶解法制备半抗原3-Ac-NEOS的方法可行且纯度较高，半抗原的制备得到优化，经柱色谱分离纯化后，得到半抗原合成率为60%左右。在蒸气浴条件下，3-Ac-NEOS与琥珀酸酐（HS）反应合成了在C8位具有连接臂的3-Ac-NEOS-HS，后通过碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联制备T-2毒素母核完全抗原，采用紫外扫描及SDS-PAGE凝胶电泳，最终确定了半抗原3-Ac-NEOS与蛋白的成功偶联，其中免疫原3-Ac-NEOS-HS-BSA内3-Ac-NEOS与BSA的偶联比为8.76：1，包被原3-Ac-NEOS-HS-OVA内3-Ac-NEOS与OVA的偶联比为7.24：1，两个都在范围(3~45)：1之间，都具有免疫原性，且其中免疫原的偶联比为8.76：1在范围(8~25)：1之间，表明能够进行免疫产生具有较高效价的抗血清。利用制备的T-2毒素母核完全抗原免疫新西兰种兔子，经间接ELISA法检测，在第五次加强免疫后的抗血清，效价达到1：64000，可用于纯化制备抗体。利用纯化后的抗体建立间接竞争ELISA法分析抗体的灵敏度和特异性，结果显示T-2毒素母核抗体相对于具有母核结构的A型单端孢霉烯族毒素特异性差，但相对于不具有母核结构的B族毒素DON的特异性强，表明T-2毒素母核抗体可识别隐蔽态T-2毒素。间接竞争ELISA对T-2毒素的检测限为49ng/mL，IC50为0.228μg/mL。同时利用包被抗原3-Ac-NEOS-HS-OVA偶联羧基磁珠，制备了可识别T-2毒素母核抗体的3-Ac-NEOS-HS-OVA-免疫磁珠（T2-IMB），并以此磁珠建立间接竞争ELISA，即免疫磁珠间接竞争ELISA（T2-IMB-ELISA）。T2-IMB-ELISA对T-2毒素母核的检测限为0.023μmol/L，相当于10.7ng/mL的T-2毒素，检测限明显低于建立的常规间接竞争ELISA法49ng/mL的检测限；对T-2毒素加标检测的平均回收率为92.37%，且变异系数均在变异系数在3.26~6.43之间，说明T2-IMB-ELISA具有较高的回收率和检测准确性。T2-IMB-ELISA被成功应用于检测对虾体内的隐蔽态T-2毒素，结果显示，以最高剂量组肝胰腺为例，检测到的隐蔽态T-2毒素为0.057nmol/尾。若全部解离为T-2毒素的，可得到T-2毒素的增量为26.7ng/尾。结果高于用解离法检测到的23.6ng/尾增量。表明了解离法处理隐蔽态T-2毒素不完全，有部分损失。T2-IMB-ELISA适合于检测对虾体内的隐蔽态T-2毒素。