论文摘要
脂环酸芽孢杆菌D-1(Alicyclobacillus tengchongensis CGMCC1504)是筛选自云南腾冲温泉中的一株嗜热嗜酸菌，属于极端微生物中的一种。极端微生物通常在极端环境下生存必须进化出独特的适应机制，因此这些微生物在物种、基因组成和生态功能上具备有多样性，同时很可能具有一些不同的代谢途径和遗传背景、这些对基因研究和生物技术应用都有很大的价值，并且将是新型酶资源开发的一个潜在的微生物来源。本论文对A. tengchongensis CGMCC1504进行了全基因组测序及生物信息学分析，从分子水平了解脂环酸芽孢杆菌的基本遗传特征、环境适应机制及代谢途径，为挖掘新型酶基因资源奠定基础；对来自其功能注释羧酸酯酶基因进行了研究，成功克隆、表达了两种羧酸酯酶CarE3和CarE5，并对其酶学性质和农药降解进行了研究，构建了细胞表面展示系统，具体研究结果如下：一、A. tengchongensis CGMCC1504全基因组测序及分析采用Illumina Solexa测序技术，完成了A. tengchongensis CGMCC1504的全基因组测序。分析表明，A. tengchongensis CGMCC1504染色体大小约为2.81Mb，GC含量为53.98%，编码2,867个CDs，基因长度2,506,377bp，占基因组89.19%，98个串联重复区域，5个5s_rRNA，60个tRNA，121个转座子，1个CRISPR-Cas系统，1个基因岛，无前噬菌体。6株脂环酸芽孢杆菌比较基因组分析，A.tengchongensis CGMCC1504只与A. hesperidum URH17-3-68具有较好的共线性，说明二者亲缘关系较近；Core/Pan分析它们的核心基因有1704个，泛基因有6651个，其中泛基因占总编码基因比例较大，说明不同脂环酸芽孢杆菌之间存在着遗传的多样性。A. tengchongensis CGMCC1504具有完整的糖酵解途径、磷酸戊糖途径和三羧酸循环过程，其完备的初级代谢途径，不但满足了自身生理活动需要，而且可以把初级代谢产物提供给次级代谢途径，产生各种具有生物活性的次级代谢产物。此外，还发现其具有多种糖合成代谢途径和多种外源有毒物质的降解途径、氮代谢途径、硫代谢途径、脂代谢途径以及与分泌蛋白相关的两个分泌系统Ⅱ和Ⅲ，这些可能与其所适应的极端环境相关。基于A. tengchongensis CGMCC1504全基因组测序功能基因的注释，筛选到两个羧酸酯酶基因CarE3和CarE5，在GenBank上登录号分别为JQ034612和JX101458，并利用生物信息学软件对羧酸酯酶CarE3和CarE5的核酸序列及其推定的氨基酸序列进行分析。CarE3和CarE5的最大开放阅读框均为1542bp，编码512个氨基酸，预测蛋白分子量分别为56kDa和57.8kDa，理论等电点(pI)分别为5.52和4.75，氨基酸最高相似性分别为57%和81%，与已报道的降解农药羧酸酯酶氨基酸最高同源性均不到40%，是两个新的水解农药的酯酶。二级结构预测，CarE3和CarE5的氨基酸序列中均含半胱氨酸，有形成二硫键的可能。多序列比对分析CarE3和CarE5都具体B型羧酸酯酶保守区，分别是(FGGDPDRVTIAGQSAG)182-197和(FGGDPENITIGGQSAG)191-206以及酯酶家族保守五肽结构GXSXG，分别是Gly193Gln194Ser195Ala196Gly197和Gly202Gln203Ser204Ala205Gly206，其中Ser195和Ser204分别是CarE3和CarE5的亲核基团的活性中心，而Ser195/Glu333/His424和Ser204/Glu325/His415分别是二者的催化三联体结构域，(HGGG)115-118和(FGGG)117-120则分别是CarE3和CarE5的氧离子残基，且CarE3和CarE5均具有典型的酯酶/脂肪酶超家族结构域，属于酯酶家族，是/β-水解酶(CL0028)中的PF00135成员。此外，对CarE3和CarE5的氨基酸序列建树分析，二者均属于脂肪酶familyⅦ成员。利用SWISS-MODEL同源建模，CarE3和CarE5与模板2ogsA序列最高相似性分别只有30.44%和28.02%。二、CarE3和CarE5的原核表达系统的构建及酶学性质的研究对来源A. tengchongensis CGMCC1504的CarE3和CarE5进行了E. coliBL21(DE3)的异源表达和性质测定。重组羧酸酯酶CarE3和CarE5最适温度分别是65℃和60℃，在6-85℃都有活性。两种酶在常温25℃相对比较稳定，重组羧酸酯酶CarE3在60℃以上保温50min，基本失去活性，而重组羧酸酯酶CarE5在60℃处理10min残余87%的活性，50min后残余36%酶活性。重组羧酸酯酶CarE3和CarE5最适pH均为7.0，pH4.8-8.0都有活性，中性条件下稳定，在偏酸或偏碱条件下均不稳定。Zn2+对两种酶均有很强抑制作用，且二者的稳定均不依赖于Ca2+；除了dichloromethane其他几种有机溶剂均对重组羧酸酯酶CarE3和CarE5均有不同程度的抑制作用。还原剂DTT和β-mercaptoethanol对重组羧酸酯酶CarE3和CarE5都有抑制作用，说明CarE3和CarE5分子内部存在二硫键。酶促动力学研究表明CarE3和CarE5对-乙酸萘酯催化活性要比β-乙酸萘酯的高，说明底物的构型对酶的催化活性有很大影响。三、重组羧酸酯酶CarE3和CarE5对农药的降解研究分别使用两种重组羧酸酯酶CarE3和CarE5对拟除虫菊酯农药(胺菊酯和氟氯氰菊酯)、氨基甲酸酯农药(西维因、仲丁威和抗蚜威)以及有机磷农药(马拉硫磷、对硫磷和敌敌畏)进行降解实验。结果表明，重组羧酸酯酶CarE3只对氟氯氰菊酯、西维因和马拉硫磷有降解作用，而重组羧酸酯酶CarE5只对氟氯氰菊酯和马拉硫磷有降解作用。在pH7.0和37℃下，1U重组羧酸酯酶CarE3在60min内可以降解55.7%氟氯氰菊酯(5mg/L)，41.18%的西维因(5mg/L)和47.1%的马拉硫磷(5mg/L)；而同样条件下，1U重组羧酸酯酶CarE5在60min内可以降解58.14%的氟氯氰菊酯(5mg/L)和70.5%的马拉硫磷(5mg/L)。四、大肠杆菌细胞表面展示羧酸酯酶CarE3和CarE5工程菌的构建及全细胞酶活性分析利用来源丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的人工合成截短冰核蛋白(inaK)的N端和NC端为锚定蛋白分别与靶蛋白羧酸酯酶CarE3和CarE5融合构建了重组质粒pET28ND3、pET28NCD3、pET28ND5和pET28NCD5，转化到E. coli BL21(DE3)，在T7强启动子作用下，经0.05mM IPTG诱导表达，以pNPB为底物测得全细胞干粉酶活性分别达到595.6U/g、539.5U/g、153.96U/g和78.7U/g，inaK-N端融合羧酸酯酶细胞酶活性明显高于inaK-NC端融合的细胞酶活性。常温保存细胞干粉酶活性保持67d。