论文摘要
油菜光、温敏细胞核雄性不育是选育两系杂交油菜的一种重要途径，选育出临界温度较高的不育系，对一系两用的应用具有重要意义。而光温敏雄性不育受基因和光温因子共同作用，其育性特征与遗传机制相对单一基因控制的雄性不育更为复杂。本文以甘蓝型油菜新型细胞核雄性不育系SP2S为研究对象，正常可育近等基因系SP2F为对照，对SP2S的育性转换规律、不育基因连锁标记筛选、细胞学观察等进行了研究，主要结果如下：1、人工气候箱试验研究，长日照14/10h(昼/夜)处理下，长日照与前人处理的短日照对不育系SP2S影响基本一致，光长对育性作用不大，温度对育性具有显著性影响，临界温度为11.8-14.8℃，温度敏感期为开花前13-14天。2、醋酸洋红染色鉴定生活力：SP2S花育性等级最高的6级育性生活力达到91.98%，到达高度可育状态，随着育性等级降低活力降低，到3级至1级时，生活力趋于稳定，保持在55%左右，表现为半不育，且长雄蕊与短雄蕊生活力无显著性差异。3、组织化学染色观察：花粉粒经醋酸洋红染色，显微镜下观察到SP2S花粉粒形状畸形，内陷变形，相互粘连，染色浅或不着色，呈现高度不育状态；SP2F花粉粒饱满呈圆形，染色后为暗红色，表明其内含物充实，SP2F花粉粒半径明显大于SP2S。半薄切片苯胺蓝染色观察花药内室绒毡层、小孢子发育及胼胝质降解过程，发现甘蓝型油菜雄性不育系SP2S四分体及小孢子被大量胼胝质包裹，而且降解困难，壁物质降解延迟使得小孢子粘连在一起。4、温敏不育基因的分子标记筛选及BnMSR66基因的分离：对351对SSR标记进行筛选,出现了6对有差异的引物，在进性单株验证，差异性条带在单株验证时没用重复出现，多态性消失。对胼胝质酶基因BnMSR66进行扩增及测序，所得片段长度为445bp，SP2F和SP2S材料的cDNA和DNA序列完全相同。包含一个全长为390bp的开放阅读框，编码130个氨基酸。序列同源性比对，与在花药中表达且与胼胝质分解有关的功能基因拟南芥AtA6基因和甘蓝型油菜BnA6基因具有很高的同源性。5、小孢子释放过程相关基因的表达分析：提取可育和不育材料不同发育阶段花蕾的RNA，反转录cDNA，对花蕾不同发育时期参与四分体外周壁上纤维素降解的基因BnQRT1，BnQRT2，BnQRT3及胼胝质降解相关基因BnA6和BnMSR66进行实时荧光PCR定量分析，这些基因在不育株中表达量比可育株中大幅度提高，胼胝质过多而且延迟降解趋势与荧光染色观察结果一致。表明绒毡层变形及功能异常导致小孢子释放有关酶基因表达异常与小孢子败育有关。