论文摘要
黄烷醇类多酚和花色苷是葡萄果实主要的多酚类物质,对葡萄果实和葡萄酒品质(如色泽、风味、口感、营养价值等)具有重要作用。本研究首先采用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得了赤霞珠葡萄果实(Vitis vinifera L. Cabernet Sauvignon) MybA2基因全长序列,构建了原核表达载体pET-mybA2,纯化了融合蛋白,并制备了MYBA2多克隆抗体；其次,采用蛋白质印迹(Western-blotting)和实时荧光定量技术(Real-Time PCR)研究了葡萄果实发育过程中MybA2的表达规律；最后对葡萄果实发育过程中MybA2与LAR1、LAR2、DFR、ANS、ANR和UFGT的表达进行了相关性分析。主要结果如下：1.葡萄果实MybA2基因包含完整的编码框,长度为798bp。编码一个由265个氨基酸组成的多肽,分子量约为31kDa。蛋白序列分析表明,葡萄果实MYBA2不存在跨膜区域,不含信号肽,为非分泌蛋白。2.在30℃,0.5mM异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET-mybA2在大肠杆菌BL21细胞中培养3h后高效表达融合蛋白。应用Ni-NTA亲和纯化回收MYBA2融合表达蛋白。以MYBA2融合蛋白为抗原制备的多克隆抗体,ELISA分析anti-mybA2IgG的效价为1：81000,具有良好的效价和特异性。3.葡萄果实发育过程中,VvmybA2在果实发育前期(花后20d至花后60d)转录表达较少；进入转色期(花后70d)后转录表达急剧增加,并在花后80d达到最大值；VvmybA2在葡萄转色期后的翻译表达量比转色前期高,且在花后90d表达量达到最大值,与其转录水平的表达模式相同。4. MybA2基因表达与UFGT基因表达呈极显著正相关,与花色苷含量呈显著性正相关。