论文摘要
目的观察Spy1在大鼠坐骨神经损伤过程中的时空表达,分析Spy1与神经元突起延伸之间的关系,探讨Spy1在周围神经损伤和修复过程中的作用。方法1.构建大鼠坐骨神经夹伤模型,提取坐骨神经mRNA和蛋白,分别采用逆转录-多聚酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)和Western blot检测Spy1的mRNA和蛋白表达变化；运用免疫组化和免疫荧光等方法检测Spy1在坐骨神经中的分布和细胞定位情况；初步明确Spy1的表达和周围神经损伤的相关性。2.运用免疫共沉淀和GST pull-down验证Spy1和SCG10(Superior Cervical Ganglion-10)之间的相互作用关系；构建Spy1和SCG10截短突变质粒,转染至工具细胞中,免疫共沉淀检测其相互作用结构域；同时运用免疫荧光双标检测Spy1与SCG10在神经元中的共定位情况；Western blot检测Spy1及SCG10在神经元轴突延伸过程中的表达变化；构建Spy1和SCG10过表达载体,转染入未分化PC12细胞并用NGF诱导突起生长,分析干预Spy1与SCG10相互作用对神经元突起延伸的影响。结果1. RT-PCR结果显示大鼠坐骨神经中Spy1mRNA水平在损伤后1d开始上升,术后3d达到高峰,随后逐渐降至正常水平；Western blot结果显示Spyl蛋白水平在损伤1d后开始上调,在3d达到高峰,与mRNA水平类似;免疫组化结果发现Spyl主要在坐骨神经夹伤处和远端表达增强；免疫荧光双标分析显示在坐骨神经夹伤处Spy1主要与NF200标记的轴突及轴突再生标记GAP43有共定位,而在远端主要与S100标记的施万细胞共定位。2.免疫共沉淀和GST pull-down实验发现Spy1和SCG10存在相互作用；Spy1通过其Speedy/RINGO box结构域与SCG10的SLD结构域结合；Western blot结果显示随着神经元突起的延伸,Spy表达逐渐降低,神经元轴突生长相关蛋白SCG10表达逐渐增强；在PC12细胞中过表达Spy1质粒,可以有效降低SCG10的表达,调节神经元轴突的生长。结论1.Spy1在坐骨神经损伤后表达上调,表达增加的Spy1主要定位于坐骨神经夹伤处的轴突和远端的施万细胞中。2.神经元突起延伸过程中Spy1表达下调,过表达Spy1可以通过与SCG10相互作用,调节神经元突起的生长。