论文摘要
大量职业研究、流行病学研究和实验研究证实,慢性砷(arsenic,As)暴露可导致反复或持续的肝脏慢性炎症、坏死,在修复过程中肝细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成与降解失衡,ECM大量沉积,形成肝脏纤维化。虽然砷与肝纤维化之间的关系已经确定,但其具体机制仍不明确。目前认为氧化损伤是砷致肝纤维化的重要机制之一,认为过量产生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)激活肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs),并刺激其增殖、分化为肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)。而HSCs为ECM的主要来源细胞,HSCs的激活是肝纤维化形成的重要环节。在肝纤维化形成过程中,转化生长因子-β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)是重要的促纤维化细胞因子,其促纤维化的作用主要通过TGF-β/smad信号转导通路实现。目前很多抗肝纤维化的治疗主要致力于阻断TGF-β/Smad信号通路、抑制HSCs的活性。氧化损伤在砷暴露致肝损伤及肝纤维化中的作用提示,抗氧化、减轻氧化应激能抑制砷诱导的肝脏损伤。因此,探寻安全有效的抗氧化物质成为目前研究的热点。葡萄籽提取物(grape seed extract,GSE)富含多酚类物质,包括儿茶素、表儿茶素和原花青素,具有强大的抗氧化抗炎能力。GSE在体内通过直接清除ROS和降低组织中炎症反应发挥其抗氧化和抗炎作用,其抗氧化能力大于维生素C、维生素E及β胡萝卜素。因此,本研究提出科学假说：GSE能减轻砷诱导的氧化损伤,对砷诱导的肝脏损伤及纤维化有保护作用。为验证和阐释上述假说,本研究拟通过体内和体外实验达到两个目标：第一,验证补充GSE能否抑制慢性砷暴露诱导的肝损伤及纤维化。第二,探讨GSE保护砷诱导肝损伤及纤维化的分子机制。研究方法健康雄性SPF级SD大鼠60只(6周龄,体重159.8±11.1g),按体重随机分为4组：对照组(自由采食、饮纯水)、GSE干预组(自由采食、饮纯水,GSE按100mg/kg体重隔日灌胃)、As暴露组(自由采食,饮30mg/L NaAs02水溶液)和GSE+As联合组。12个月实验期后,HE染色观察肝组织形态学改变；ELISA测肝功能和炎症因子；Real Time-PCR测肝纤维化相关标志物；分光光度法测抗氧化水平；化学荧光法、TBA法和分光光度法分别测活性氧(Reactiveoxygen species,ROS)、丙二醛、蛋白质羰基含量；Western blot测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase,NOX)主要亚基及pSmad2/3的蛋白表达。采用大鼠肝星状细胞株(HSC-T6),化学荧光法、NADPH法测不同剂量GSE对As诱导HSC内ROS水平和NOX活性的影响；化学荧光法分别测As诱导二苯基碘(DPI)孵育的HSCs和Nox4siRNA干扰的HSCs产生ROS的水平；化学荧光法、NADPH法、Real Time-PCR分别测GSE对As诱导Nox4过表达的HSCs内ROS水平、NOX活性及肝纤维化相关因子的水平；荧光素酶活性检测GSE对TGF-β/Smad途径的作用；Real Time-PCR测GSE对TGF-p诱导Smad3过表达的HSCs内纤维化标志物的影响。SPSS13.0对数据进行录入和处理。均数±标准差(x±s)对资料进行描述,多个样本均数的比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准a=0.05。结果1.与对照组相比,As暴露组大鼠的体重降低、肝脏系数增加,血清中ALT、AST、胆红素水平升高,白蛋白水平降低,促炎症细胞因子(IL-1β、IL-6、和TNF-α)水平增加,促纤维化因子表达水平增高(P均<0.05)。GSE+As联合干预组大鼠的这些指标,与对照组相比差异均无统计学意义(P均>0.05)；而与As暴露组相比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。在形态学上,As暴露组大鼠肝脏发生了纤维化改变；2.与对照组相比,As暴露大鼠肝组织中抗氧化物、抗氧化酶水平降低,氧化产物、ROS、脂质过氧化产物及蛋白质羰基的含量升高(P均<0.05)；GSE+As联合干预组大鼠的这些指标,与对照组相比差异均无统计学意义(β均>0.05)；而与As暴露组相比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。3.与对照组相比,As暴露大鼠肝组织NOX的亚基Nox2、Nox4和p47phox的表达水平升高,磷酸化Smad2/3的水平升高(β均<0.05)；GSE+As联合干预组大鼠肝组织NOX亚基的水平及磷酸化Smad2/3的水平与对照组相比差异无统计学意义(P均>0.05),与As暴露组相比,明显降低(P均<0.05)。4.细胞实验表明,GSE剂量依赖性地抑制砷诱导HSCs内ROS水平及NOX活性(P<0.05)；与阴性对照相比,砷可以诱导HSCs产生ROS增加(P<0.05)；而DPI与砷共同孵育细胞后,ROS的产生受到抑制(P<0.05)；进一步应用砷刺激沉默Nox4基因的HSCs,发现ROS的生成量减少(P<0.05)。同时GSE对As诱导Nox4过表达HSCs内ROS水平、NOX活性及致纤维化因子的表达有抑制作用(P均<0.05)。5.GSE剂量依赖性地抑制TGF-β/smad信号通路(P<0.05);GSE对TGF-β诱导的Smad3过表达HSCs内肝纤维化相关基因的表达有抑制作用(P均<0.05)。结论1)慢性砷暴露导致肝脏的炎症反应、氧化应激,肝功能受损,NOX活性升高,肝纤维化相关基因表达增加,同时激活了TGF-β/smad信号通路,导致肝纤维化的发生。2)GSE能抑制肝脏的炎症反应,减轻氧化应激,改善肝功能,抑制NOX活性,降低肝纤维化相关基因表达,抑制TGF-β/smad信号通路。3)GSE通过抑制NOX活性减轻氧化应激和炎症反应；并通过抑制TGF-β/smad信号途径减轻砷诱导的肝纤维化。