论文摘要
众所周知，药物研发过程具有风险高、投资大、周期长的特点。在药物研发的临床前阶段，毒性问题是制约研发成功与否的主要问题之一，因此在药物研发早期，严格淘汰因毒性问题不适宜进一步研发的化合物，有利于降低投资风险、节约药物研发成本。如何在研发早期尽早发现候选化合物的潜在毒性，从而加快药物研发进程、降低药物研发费用、提高研发成功率成为毒理学研究的重要方向。近年来，抗菌药物是目前临床药物治疗中最常用的药物，人们越来越重视抗菌活性及抗菌活性持续时间对抗菌药物疗效的影响，抗菌活性的持续时间主要与药物的半衰期密切相关。目前用于治疗G+菌包括耐甲氧西林金葡球菌(MRSA)、甲氧西林敏感金葡球菌(MSSA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、链球菌等具有抗菌活性的药物中，疗效最为肯定的抗生素为万古霉素[1]，[2]、去甲万古霉素[3]、替考拉宁[4]等。但万古霉素的半衰期较短为6h，用药间隔短[1]，[2]。去甲万古霉素[3]、替考拉宁[4]的半衰期也较短。鉴于国内外对于抗菌药物的需求形势[5]，[6]，B7011为一种新型半合成糖肽抗生素，作用机制为抑制G+菌细胞壁的生物合成，被广泛用作治疗皮肤和软组织感染的药物。B7011对于G++菌包括耐甲氧西林金葡球菌(MRSA)、甲氧西林敏感金葡球菌(MSSA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、链球菌等具有抗菌活性，其具有抗菌活性强、没有剂量限制性副作用、半衰期长的优势。本试验目的是揭示B7011在动物体内动态变化规律，阐明该药物的吸收、分布、代谢和排泄过程及特点，为该药物的药效学和毒理学评价研究提供试验参考资料，并为设计和优化临床研究方案提供依据。本研究建立和确证沉淀样品的液质联用仪检测方法，从分析线性范围、批内批间精密度、回收率、基质效应等指标进行方法确证。选择SD大鼠作为实验对象，对B7011的吸收、分布、代谢和排泄进行了部分的研究。建立了分析测定SD大鼠血浆中B7011的LC-MS/MS的方法。对大鼠血浆方法学全面确证结果表明：空白SD大鼠血浆中的内源性物质不干扰B7011的测定，方法的专属性较好。B7011测定的线性范围为30-20000μg/L，最低定量限均为30μg/L。SD大鼠血浆中B7011在60，1000，16000和10000μg/L测定的批内精密度(RSD%)分别为5.61-13.31%，2.31-8.35%，2.02-9.47%和4.0-15.0%，SD大鼠血浆中B7011在60，1000，16000和10000μg/L批间精密度(RSD%)分别为10.05%、2.55%、3.75%和8.58%；B7011的基质效应85.90%~102.14%之间，60、1000和16000μg/L三个浓度测定的回收率为：114.12%、109.2%和101.06%。B7011未处理的血浆质控样品在4℃放置4h和-20℃放置且冻融3个周期后10天和71天条件下存放是稳定的。大鼠血浆、胆汁、尿、粪和组织样品中B7011测定的随行标准曲线和质控样品的分析结果表明：上述生物基质中B7011测定方法能够满足试验的需要。建立了测定比格犬血浆中B7011的LC-MS/MS的分析方法。比格犬血浆方法学全面确证结果表明：空白比格犬血浆中的内源性物质不干扰B7011的测定，方法的专属性较好。B7011测定的线性范围均为30-20000μg/L，最低定量限均为30μg/L。比格犬血浆中B7011在60，1000，16000和10000μg/L测定的批内精密度(RSD%)分别为4.17-15.80%，2.21-19.33%，3.08-7.01%和2.64-8.6%，比格犬血浆中B7011在60，1000，16000和10000μg/L批间精密度(RSD%)分别为5.08%、6.25%、6.61%和11.27%； B7011的基质效应为84.35%~92.31%之间，60、1000和16000μg/L三个浓度测定的回收率为：109.12%、106.05%和95.97%。B7011未处理的血浆质控样品在在4℃放置4h和-20℃放置且冻融3个周期后10天的条件下存放是稳定的。供试品分析方法学全面确证结果表明： B7011在220nm波长有较大光吸收值，因此确定其为UV-2450紫外分光光度计测定该供试品的检测波长。B7011在2.5-80μg/mL检测呈现有良好线性关系。B7011在6，30和75μg/ml测定的批内精密度(RSD%)分别为0.29-0.67%，0.19-0.55%和0.23-0.42%，批间精密度(RSD%)分别为4.38%、2.25%和1.52%；在室温放置4h、冷藏放置3d具有良好稳定性，方法学验证表明该方法符合药物浓度检测的要求。分析了动物给药液浓度，SD大鼠试验所用的B7011系列浓度（0.025、0.5和3mg/ml）的偏差在0.54-5.54%范围内，保证了给予动物药量的准确性。SD大鼠单次静脉注射B7011（0.25、5.0和30mg/kg，n=8只/剂量，雌雄各4只），根据统计距参数，0.25、5.0和30mg/kg三个剂量组的AUC(0-t)分别为：26175.19±1859.60μg/L*h、580494.56±41805.61μg/L*h和3659621.61±420083.79μg/L*h;环比值为1.00：22.18：6.30,表明B7011在动物体内暴露量与剂量基本呈现线性关系；三个剂量组的平均驻留时间MRT(0-t)分别为：31.62±2.07h、27.1±1.38h和23.16±0.42h，消除半衰期t1/2z分别为：98.33±43.17h、88.48±37.47h和128.66±73.29h，三个剂量之间消除半衰期无统计学差异，表明B7011在大鼠体内消除慢，并且符合线性药代动力学特征。各动力学参数无明显性别差异。SD大鼠以5mg/kg的剂量重复静脉注射B7011，每4天静脉注射给药一次，连续给药7次，n=8只/剂量，雌雄各4只。首次给药后，B7011的主要动力学参数：AUC(0-t)为580494.56±41805.612μg·h·L-1，平均驻留时间MRT(0-t)是27.1±1.38h，消除半衰期T1/2z为88.4837.47h。末次给药后的主要动力学参数：AUC(0-t)为990961.07±72683.71μg·h·L-1，平均驻留时间MRT(0-t)是33.91±1.85h，消除半衰期T1/2z为111.4548.55h。末次与首次给药相比，AUC(0-t)体内药物暴露量增加到1.71倍，无统计学意义（p>0.05），MRT(0-t)和t1/2z均有一定延长（P>0.05）。此外，随给药时间延长，谷浓度有升高趋势，说明每4天给药1次、连续7次给药后药物在SD大鼠体内有一定的蓄积。SD大鼠静脉注射B7011（5mg/kg），8只/时间点/剂量，雌雄各4只。给药后3个采样时间点（1h、3d和6d），各组织脏器中B7011含量在雌雄大鼠之间无明显差异。给药后1h，血浆中药物浓度最高，其次，肾脏、膀胱、脂肪中的药物浓度相对也较高，其他组织脏器药物浓度基本相当。给药后3d，血浆中药物浓度明显下降，肾脏、肾上腺、在肝脏上升，居前三位。给药后6天，血浆中的药物浓度继续下降，肾上腺、肾脏、肝脏中的药物浓度下降，但仍维持在相对较高水平。说明给药后药物在肾上腺、肾脏、肝脏组织脏器内分布浓度较高。SD大鼠静脉注射5mg/kg的B7011，在尿液收集过程中，0-5h,5-12h雌雄大鼠的排泄量有差异（p<0.05）,其他时间段雌雄之间无差异（P>0.05）。在胆汁和粪便的排泄过程中雌雄之间无差异（P>0.05）。0～144h胆汁中收集到的B7011的量为给药量的0.700.10%；0～480h尿液中收集到B7011的量为给药量的14.685.91%；0～480h粪便中收集到B7011的量为给药量的0.520.21%。粪便和尿液中共回收到B7011为15.20%。表明大鼠静脉注射B7011后，吸收进入体内的药物只有一小部分以原形被排出体外，其余药物发生了代谢转化。药代动力学药效学研究表明：给药组1mg/kg中B7011的药-时曲线符合静脉给药趋势的特点。模型对照组：随着时间的延长菌落个数增加。实验组：0-2h时间内实验组与模型组菌落计数比值变化不明显；2-4h时间内，四个剂量的比值变化呈现剂量依赖趋势，4-12h模型组菌落数变化不明显，此时间段菌落变化呈平台趋势；12-48h模型组菌落数呈增长趋势，实验组4个剂量与模型组菌落计数比值变化明显（比值下降到7至28倍），菌落数减少，抗菌效果呈现时间依赖性趋势。结论：1.本研究建立了分析测定SD大鼠血浆、组织、胆汁、尿液、粪便，以及比格犬和小鼠血浆中B7011的LC-MS/MS的方法。该方法的专属性较好，线性良好，批内、批间精密度符合方法学要求，基质效应对样品检测影响小，沉淀蛋白提取标品的方法回收率较高。2. B7011溶液供试品分析方法进行验证，结果表明符合方法学要求，并分析了动物给药液浓度，保证动物给药量的准确性。3.3个剂量（0.25、5.0和30mg/kg）的B7011单次静脉给药后在大鼠体内基本呈现线性动力学特征，消除半衰期长，体现了本药物的抗菌优势的动力学特征。4. SD大鼠以5mg/kg的剂量，每4天静脉注射给药1次，连续7次。与首次给药相比，体内药物暴露量略有增加。此外，随给药时间延长，谷浓度有升高趋势，说明每4天给药1次、连续7次给药后药物在SD大鼠体内有一定的蓄积。5. SD大鼠静脉注射B7011（5mg/kg）后，给药后3个采样时间点（1h、3d和6d），各组织脏器中B7011含量在雌雄大鼠之间无明显差异。给药后药物在肾上腺、肾脏、肝脏组织脏器内分布浓度较高，而且排泄较慢，有一定的蓄积趋势。6.大鼠静脉注射给予B7011后，吸收进入体内的药物只有一小部分以原形被排出体外，其余药物发生了代谢转化。7.建立的小鼠金黄色葡萄球菌感染败血症模型，数据初步研究表明，该模型稳定可靠，药物抗菌药物治疗效果显著，可用于进一步抗菌药的药效药代模型研究。