论文摘要
血小板由骨髓巨核细胞产生，不仅具有凝血、止血功能，而且还参与机体抗感染、血管及组织修复等重要病理生理过程。骨髓为辐射敏感器官，当人员暴露于电离辐射后，骨髓造血干细胞的增殖与分化活性受到抑制，从而引起体内巨核细胞数量严重减少，导致外周血血小板水平低下，易发生恶性出血、感染甚至危及生命。此外，临床上原发性或继发性血小板减少症也颇为常见，如特发性血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血以及恶性肿瘤化/放疗等也可导致血小板减少症的发生。促进巨核细胞增殖分化，加速血小板的生成是提高外周血血小板水平、有效救治血小板减少症的关键所在。然而，目前临床上针对血小板减少症的特效药物和救治手段较为缺乏，并且还存在着毒副反应突出、治疗费用高昂等诸多缺陷。所以，探寻高效促血小板生成药物并对其作用机制进行深入研究具有重要意义。促血小板生成素(Thrombopoietin,TPO),又称巨核细胞生长及发育因子(megakaryocyte growth and development factor, MGDF)，共由332个氨基酸组成，能够与巨核细胞表面相应的受体c-Mpl结合，从而刺激巨核系祖细胞/巨核细胞的增殖与成熟分化，并最终促进血小板的产生与释放。TPO是目前已知的巨核细胞及血小板系统最主要、作用最强的细胞调节因子。但是，通过基因工程制备并经聚乙二醇修饰的第一代巨核系生长因子类基因工程药物(rhTPO和rhMGDF)因在临床试验过程中诱发机体产生针对TPO的中和性抗体，造成自身内源性TPO活性受抑，从而导致血小板数量进一步减少。因此，美国食品与药品管理局(FDA)至今未批准rhTPO类药物进入临床。目前国外研究机构已基本停止了对重组人TPO的药用研发，转而探寻TPO类似物或其它模拟物。Cwirla等学者于1997年运用噬菌体表面展示技术筛选到了一种与天然TPO生物学特性相似而又与TPO无序列同源性的短肽(仅由14个氨基酸构成)，命名为促血小板生成素模拟肽(Thrombopoietin mimetic peptide, TMP)。研究证实，TMP与巨核细胞表面TPO受体(c-Mpl)具有较高的亲和能力，可促进依赖TPO细胞株的增殖和分化，而且由于与天然TPO无相同氨基酸序列，所以不会诱导机体产生TPO中和性抗体。但是，由于其促血小板生成活性相对较弱，且在机体内半衰期较短，导致其推广应用受到极大限制。研究发现，TPO之所以具有突出的促巨核细胞增殖、分化和升血小板活性，是因为它能够同时结合两个配对的c-Mpl分子，而也只有当c-Mpl分子形成二聚体后才能激活胞内有关增殖、分化的信号通路。由于一个TMP单体肽只能结合一个c-Mpl分子，所以尽管其与c-Mpl分子具有较高的亲和力，但是其促巨核细胞增殖、分化的活性并不突出。如果将两条TMP单链连接形成TMP二联体(dTMP)，一个dTMP多肽则可以同时结合两个配对的c-Mpl分子，从而显著提高其促血小板生成活性。有研究报道，促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)的模拟肽EMP1与同源肽EMP33均可与受体EPOR结合，但是EMP33并不能激活EPOR下游的JAK-STAT信号通路，原因在于EMP1和EPOR的复合体与EMP33和EPOR的复合体的旋转角度不同(相差约15度)。有研究提示两个EMP1之间的连接肽可以调节两个EMP1的角度，所以选择合适的连接肽对于提高EMP1二聚体的活性至关重要。同理，两个TMP之间连接肽的选择也会对dTMP与c-Mpl的结合及其促血小板生成活性产生显著影响。因此，为了寻找具有突出升血小板活性的dTMP线性多肽，在本研究中我们首先设计并合成了一系列由不同连接肽将两个TMP头尾串联起来的dTMP多肽，从长度及氨基酸组成两个层面对连接肽进行筛选。然后，从激活细胞内相关信号通路的角度探讨dTMP优选肽促巨核细胞增殖分化的作用机制，同时，结合分子动力学模拟及分子对接软件对dTMP的三维结构及其与受体c-Mpl的结合方式进行分析。最后，复制急性放射损伤小鼠血小板减少症实验动物模型，观察dTMP优选肽对放射损伤所致小鼠血小板减少的救治作用。所获得的主要研究结果与结论如下：1.连接肽长度对dTMP的促巨核细胞增殖活性具有显著影响，其中由8个G(甘氨酸)作为连接肽的dTMP活性较为突出。2.通过对连接肽的氨基酸组成进行调整，发现在连接肽结构中加入脯氨酸(Proline,P)可显著提升dTMP的促巨核细胞增殖活性。3.通过两轮筛选最终获得与等摩尔TPO具有相似活性的dTMP优选肽(命名为No.341多肽)。4.小鼠骨髓原代巨核细胞检测结果显示，经No.341多肽刺激培养14天，小鼠Sca+-I细胞表面CD41/CD61(巨核细胞成熟标志物)的表达水平较IL-3对照组显著增高(83.26±6.26%vs15.70±2.31%, P＜0.01)，进一步证实该TMP二联肽具有显著促巨核细胞成熟、分化的作用。5. Western blot结果显示，dTMP(No.341多肽)作用10min即可显著上调M07e细胞内JAK-STAT5及ERK1/2的磷酸化水平。另一方面，给予JAK-STAT和ERK信号通路阻断剂则可以显著抑制No.341多肽的促巨核细胞增殖作用，提示dTMP生物活性的发挥与其能够快速激活STAT5和ERK1/2信号通路有关。6.分子动力学模拟及分子对接分析结果表明，连接肽的长度和氨基酸组成可以显著影响dTMP的空间构象，包括两条TMP单链之间的角度、跨度以及活性位点的暴露等，并能决定dTMP与c-Mpl的分子对接方式，在一定程度上揭示了连接肽影响dTMP活性的内在机制。7.与生理盐水对照相比，dTMP(No.341多肽)能够显著提高急性放射损伤(5GyCo60γ射线照射)小鼠的外周血血小板最低值水平，并能促进血小板水平恢复，证实dTMP对血小板减少症具有显著救治作用。