论文摘要
目的：本研究从内皮细胞的胰岛素受体底物-2/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号途径以及还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4-活性氧-不对称二甲基精氨酸系统两个通路入手，采用细胞培养、生化检测试剂盒、RT-PCR和Western blot等技术手段，探讨并观察经典方剂六味地黄丸含药血清对高浓度软脂酸所致血管内皮细胞功能损伤的保护作用，从细胞及分子水平揭示其作用机制，寻找防治糖尿病及血管病变的新靶点，为六味地黄丸治疗糖尿病及并发症提供理论基础及实验依据，并建立新的研究平台。材料与方法：论文一：①六味地黄丸含药血清的制备。将52只SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠按随机数字法分为正常对照组和六味地黄丸（liuweidihuang pill，LWDHP）中药组，中药组给予六味地黄丸粉末水溶液（生药质量浓度为15g/kg·d）灌胃，正常对照组给予等体积的生理盐水，连续灌胃6d。然后施行10%水合氯醛腹腔麻醉，于腹主动脉采血，室温下血液自然凝固，离心后分离血清，56℃水浴灭活，过滤除菌，分装封口，-80℃保存备用。②EA.hy926人脐静脉内皮细胞（human umbilical vascular endothelialcells，HUVEC）的培养及细胞模型的建立。EA.hy926HUVEC于37℃，5%CO2的孵育箱中常规培养，每2d换液1次，3～4d传代1次。取对数生长期的EA.hy926HUVEC，调整密度为0.5×105个/mL接种于96孔培养板中，200μL/孔，设定正常对照组和5个不同浓度梯度的软脂酸（palmitic acid，PA）组，每组6个复孔。待细胞90%生长融合后，加入PA使终浓度为200μmol/L，300μmol/L，400μmol/L，500μmol/L，600μmol/L，孵育1h后，再加入胰岛素使其终浓度为50nmol/L。PA作用24h诱导内皮细胞（endothelial cell，EC）损伤后，加入浓度为5mg/mL的MTT20μL，培养箱内继续作用4h，去掉培养基，加入二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）150μL震荡细胞15min，于酶标仪（波长490nm）检测光密度（optical density，OD）值，计算细胞增殖率约为正常对照组的50%～60%，与正常对照组比较有显著性差异，即可筛选出PA造模的最佳浓度，形成细胞损伤模型用于后续实验。③六味地黄丸含药血清对PA损伤的EA.hy926HUVEC增殖的影响。取对数生长期的EA.hy926细胞接种于96孔培养板中培养，分为正常对照组，模型组（PA终浓度为400μmol/L），六味地黄丸中药治疗组（2.5%、5%、10%、20%含药血清），二甲双胍（metformin，MET）组。待细胞90%生长融合后，六味地黄丸中药治疗组换成不同浓度梯度的含2.5%、5%、10%、20%大鼠血清的DMEM培养基，MET组加入MET使其终浓度2mmol/L，继续培养干预保护24h。模型组、六味地黄丸组及MET组各加入PA作用1h后，再加入胰岛素使其终浓度50nmol/L。PA作用24h后，即刻镜下观察各组细胞生长的形态特征，随后加入MTT作用4h，加DMSO震荡细胞15min，于490nm波长检测OD值，计算细胞增殖率为正常对照组的70%～80%，六味地黄丸组与模型组比较有显著性差异，即可舍弃掉不理想浓度的六味地黄丸含药血清，余下的浓度梯度用于后续实验。论文二：①细胞培养基中一氧化氮（nitric oxide，NO）含量的检测。取对数生长期的EA.hy926HUVEC接种培养，分为正常对照组，模型组，六味地黄丸中药组（2.5%、5%、10%含药血清），MET组。待细胞90%生长融合后，六味地黄丸治疗组换成不同浓度梯度的含2.5%、5%、10%大鼠血清的DMEM培养基，MET组加入MET继续培养24h。加入PA和胰岛素24h后，各组分别收集培养基按照检测试剂盒的说明进行操作，于540nm测定OD值，检测NO含量。协助筛选出最佳的六味地黄丸含药血清浓度，用于后续实验。②RT-PCR测定细胞胰岛素受体底物-2（insulin receptor substrate-2，IRS-2），磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidy linositide-3kinase，PI3K），蛋白激酶B（proteinkinases B，PKB/Akt），内皮源型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）mRNA的表达。调整细胞密度为4×105个/mL接种到25cm2培养瓶内，每瓶加4mL培养基，分为正常对照组，模型组，5%六味地黄丸含药血清治疗组，MET组。待细胞90%生长融合后，六味地黄丸治疗组换成含5%大鼠血清的DMEM培养基，MET组加入MET继续培养24h。加入PA和胰岛素24h后，弃去培养基，收集细胞，提取细胞总RNA，用RT-PCR试剂盒进行逆转录及聚合酶链反应。凝胶成像系统分析电泳图像，以各组样本目的基因条带光密度值和对应的β-actin条带光密度值的比值表示各目的基因mRNA的表达量。③Western blot测定细胞IRS-2，PI3K，P-Akt，eNOS蛋白表达。调整细胞密度为5×105个/mL接种到25cm2培养瓶内，每瓶加5mL培养基，分为正常对照组，模型组，5%六味地黄丸含药血清治疗组，MET组。待细胞90%生长融合后，六味地黄丸治疗组换成含5%大鼠血清的DMEM培养基，MET组加入MET继续培养24h。加入PA和胰岛素24h后，弃去培养基，收集细胞，提取细胞总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测各样本蛋白浓度，调整各组的蛋白质上样量（55μg），进行电泳、转膜、封闭、一抗、二抗、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色。扫描条带，软件分析，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参，各组目的蛋白表达强度和内参GAPDH蛋白表达强度进行比值显示各组目的蛋白表达水平。论文三：①检测细胞裂解上清液中丙二醛（malonyldialdehyde MDA）含量、总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及细胞培养基中不对称二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）浓度。取对数生长期的EA.hy926HUVEC接种培养，分为正常对照组，模型组，六味地黄丸中药组（2.5%、5%、10%含药血清），MET组。待细胞90%生长融合后，六味地黄丸治疗组换成不同浓度梯度的含2.5%、5%、10%大鼠血清的DMEM培养基，MET组加入MET继续培养24h。加入PA和胰岛素24h后，各组分别收集培养基和细胞，按照各自的检测试剂盒的说明进行操作，于532nm、560nm、450nm测定OD值，分别检测MDA含量、总SOD活性、ADMA浓度。最终筛选出最佳的六味地黄丸含药血清浓度，用于后续实验。②RT-PCR测定细胞还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-4，NOX4），蛋白质精氨酸甲基转移酶1（protein arginine methyltransferase-1，PRMT1），二甲基精氨酸二甲胺水解酶2（dimethylarginine dimethylaminohydrolase-2，DDAH2）mRNA的表达。调整细胞密度为4×105个/mL接种到25cm2培养瓶内，每瓶加4mL培养基，分为正常对照组，模型组，5%六味地黄丸含药血清治疗组，MET组。待细胞90%生长融合后，六味地黄丸治疗组换成含5%大鼠血清的DMEM培养基，MET组加入MET继续培养24h。加入PA和胰岛素24h后，弃去培养基，收集细胞，提取细胞总RNA，用RT-PCR试剂盒进行逆转录及聚合酶链反应。凝胶成像系统分析电泳图像，以各组样本目的基因条带光密度值和对应的β-actin条带光密度值的比值表示各目的基因mRNA的表达量。③Western blot测定细胞NOX4、PRMT1、DDAH2蛋白的表达。调整细胞密度为5×105个/mL接种到25cm2培养瓶内，每瓶加5mL培养基，分为正常对照组，模型组，5%六味地黄丸含药血清治疗组，MET组。待细胞90%生长融合后，六味地黄丸治疗组换成含5%大鼠血清的DMEM培养基，MET组加入MET继续培养24h。加入PA和胰岛素24h后，弃去培养基，收集细胞，提取细胞总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测各样本蛋白浓度，调整各组的蛋白质上样量（55μg），进行电泳、转膜、封闭、一抗、二抗、DAB显色。扫描条带，软件分析，以GAPDH作为内参，各组目的蛋白表达强度和内参GAPDH蛋白表达强度进行比值显示各组目的蛋白表达水平。所有数据以均数±标准差（x s）表示，使用SPSS19.0统计分析软件进行单因素方差分析后进行组间LSD分析。P＜0.05，认为有显著性差异，P＜0.01有极显著性差异。结果：1. PA最佳造模浓度的筛选。不同浓度梯度（200μmol/L，300μmol/L，400μmol/L，500μmol/L，600μmol/L）的PA作用EA.hy926细胞后，OD值和细胞增殖率逐渐下降，与正常对照组比较均有显著性差异（P＜0.01），选取使细胞增殖率为50.48%时的PA浓度400μmol/L为细胞造模的最佳浓度。2.各组细胞形态特征的观察。正常对照组的细胞为扁平多角形或梭形，边界清楚，呈单层铺路石状镶嵌排列。PA组细胞收缩变形成多星状形或椭圆形，连接断裂分离，轮廓不清，胞浆内有暗色颗粒。2.5%六味地黄丸含药血清组的细胞数量少，密度低；5%含药血清组的细胞数量和形态接近正常对照组；10%含药血清组的细胞数量和密度加大，高于正常对照组；20%含药血清组的细胞数量和密度几乎接近5%含药血清组。MET组的细胞接近正常对照组。3.六味地黄丸含药血清对EA.hy926HUVEC增殖率的影响。用不同浓度的六味地黄丸含药血清对细胞进行干预保护，2.5%六味地黄丸含药血清组的细胞增殖率只有31.67%；5%、10%及20%含药血清组细胞增殖率分别为77.46%、130.87%及85.86%，均明显高于模型组（P＜0.01）；20%含药血清的增殖率与5%含药血清的增殖率比较，没有显著性差异（P＞0.05），因此可初步筛选出5%六味地黄丸含药血清作为最佳的治疗浓度。4. PA损伤的细胞培养基中NO含量减少，与正常对照组比较，有显著性差异（P＜0.01）。2.5%六味地黄丸含药血清组NO含量进一步减少；5%、10%六味地黄丸含药血清组及MET组均能显著增加细胞培养基中NO含量，与PA组比较有显著性差异（P＜0.01），但三者之间互相比较没有显著性差异（P＞0.05）。5.模型组细胞内IRS-2，PI3K，Akt，eNOS mRNA和蛋白的表达量显著减少，与正常对照组比，有显著性差异（P＜0.01）。5%六味地黄丸含药血清组和MET组细胞内IRS-2，PI3K，Akt，eNOS mRNA和蛋白表达量增加，与模型组比，差异显著（P＜0.01），意味着六味地黄丸干预保护后可以促进PA诱导损伤的EA.hy926细胞内IRS-2，PI3K，Akt，eNOS mRNA和蛋白的表达。6. PA损伤的细胞裂解液中MDA含量增高，总SOD活性显著下降，细胞培养基中ADMA含量明显增高，正常对照组比较，有显著性差异（P＜0.01）。2.5%六味地黄丸含药血清组的MDA含量稍降低，与模型组比较有差异（P＜0.05），ADMA含量降低不明显，与模型组比较没有差异（P＞0.05），总SOD活性与模型组比较几乎没有变化，没有差异（P＞0.05）。5%和10%六味地黄丸含药血清和MET能显著降低MDA含量和ADMA含量，增加总SOD活性，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）。7.与正常对照组比，PA组细胞内NOX4和PRMT1mRNA和蛋白的表达量显著升高（P＜0.01），DDAH2mRNA和蛋白的表达量显著降低（P＜0.01）。与PA组比，5%六味地黄丸含药血清组和MET组细胞内NOX4和PRMT1mRNA和蛋白的表达量明显下降（P＜0.01），DDAH2mRNA和蛋白表达量明显升高（P＜0.01）。结论：1. PA对EA.hy926HUVEC有非常强烈的毒性作用，采用PA模拟建立胰岛素抵抗（insulinresistance，IR）细胞模型获得成功而且造模稳定。2.六味地黄丸含药血清能促进PA损伤的EA.hy926HUVEC增殖，增加细胞的增殖率。3.六味地黄丸含药血清组的细胞损伤有明显的减轻，说明其对EC具有明显的保护作用。4.六味地黄丸含药血清能够增加PA损伤的EA.hy926细胞培养基中NO的含量，同时也促进eNOS mRNA和蛋白的表达，提示六味地黄丸干预保护后通过eNOS mRNA和蛋白的表达有效促进NO的合成，从而发挥其保护作用。5.六味地黄丸含药血清能够促进EC中IRS-2，PI3K，Akt mRNA和蛋白的表达量，意味着通过IRS-2/PI3K/Akt途径进一步增加eNOS mRNA和蛋白的表达及NO的合成，从而保护受损细胞，改善和纠正IR。6.六味地黄丸含药血清能显著降低PA损伤HUVEC的MDA含量，增加总SOD活性，同时能下调受损细胞的NOX4mRNA和蛋白表达，证明六味地黄丸能降低PA对HUVEC的氧化损伤程度，增强抗氧化酶的活性，改善受损的EC状态，提示六味地黄丸可能通过抑制NOX4的表达进而发挥它的抗氧化功效。7.六味地黄丸含药血清能引起PRMT1表达明显下降，DDAH2表达明显升高，从而显著降低ADMA含量，证明六味地黄丸也可以通过其抗氧化保护作用，在一定程度上调节PRMT1-DDAH2-ADMA的表达，抑制氧化应激反应，改善氧化应激损伤。8.进一步提示六味地黄丸通过PI3K/Akt途径增加NO含量来保护EC与调节NOX4-ROS（MDA）及PRMT1-DDAH2-ADMA通路有着密切关系。