论文摘要
地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)属于玄参科（Scrophulariaceae）多年生草本植物，是传统的道地中药材，一直被视为中药材的上品，是我国著名的“四大怀药”之一。地黄含有许多对人体有益的活性成分，其中研究和应用较多的是环烯醚萜苷类物质——梓醇。一直以来，微生物都是人们获取活性物质的丰富资源，许多具有良好治疗效果的抗生素都是从微生物中得到的。近几年研究发现，植物内生真菌广泛存在于许多植物中，种类繁多，且某些植物内生真菌具有能够产生与宿主植物相同或相似活性成分的特性，因此，药用植物内生真菌在农业和医药业中具有很大的应用潜力。目的：探讨地黄内生真菌及其次生代谢产物的相关性，初步了解其内生真菌的多样性。尝试从内生真菌中筛选出产地黄活性成分——梓醇的菌株，并对筛选出的活性菌株进行发酵工艺的优化及高产诱变，以期获得稳定的高产突变菌株。方法：本课题以地黄不同营养器官（块根、叶片）及块根的不同部位（表皮、韧皮部、木质部）为试验材料，采用组织块法对其进行内生真菌的分离、纯化及鉴定，研究其内生真菌的种类、组成及其在不同器官或部位中的分布特点；将分离出的内生真菌进行发酵培养，采用TLC法、HPLC法等方法来筛选产梓醇的内生真菌，并研究其生物学特性；采用单因素试验和L9（34）正交试验对所筛选出的高产活性菌株进行发酵工艺的优化；采用单因素诱变和复合诱变的方法筛选出高产突变菌株，并结合HPLC法对梓醇产量进行测定；利用分子生物学对一株产梓醇的高产菌株CB37进行鉴定。结果：1、地黄内生真菌种群结构的研究从地黄不同营养器官或部位中共分离得到内生真菌362株，其中有282株产孢子，经鉴定分布在5目、6科、11个属，其中镰孢菌属真菌共97株，占所有已鉴定出菌株的34.4%，为地黄内生真菌的优势菌属。2、地黄内生真菌次生代谢产物——梓醇的研究通过对地黄不同营养器官和块根不同部位的内生真菌进行分离和纯化，利用TLC法和HPLC法检测发现，不同器官和部位中均不同程度的存在可以产梓醇的菌株，但其含量有所差别。共筛选出7株具有产梓醇能力的菌株，其中，产梓醇含量最高的菌株编号为CB37，它是分离自表皮的内生真菌，其梓醇产量达到2.31g/L（地黄植株中块根表皮部位的梓醇含量为2.92%）。3、产梓醇内生真菌CB37最优发酵工艺的研究通过单因素试验和正交试验相结合的方法，筛选出菌株CB37的最优发酵工艺为：以PDB培养基为基础，分别加入葡萄糖10.0g/L、酵母膏15.0g/L，培养基起始pH7.0，以2%的接种量接种于50mL培养基中，28℃恒温震摇（120r·min-1）培养6d。与初始培养条件相比，菌丝生物量达到2.73g/L，增幅为7.77%，梓醇产量达到2.38g/L，增幅为2.89%。4、产梓醇内生真菌CB37高产诱变的研究通过采用紫外诱变、亚硝酸诱变的单因素诱变和二者复合诱变相结合的方法，对具有产梓醇能力的菌株CB37进行诱变育种，选育出梓醇的高产突变菌株B-UH-5，其产量可以达到2.71g/L，较出发菌株CB37增产17.32%，将B-UH-5进行十次传代培养，表明其具有一定的遗传稳定性。5、产梓醇内生真菌CB37的分子生物学鉴定通过将供试菌株CB37的ITS序列与NCBI数据库中相似性高的序列进行BLAST比对，结合形态学鉴定方法，将菌株CB37鉴定为镰孢菌属尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。结论：通过对地黄内生真菌及其次生代谢产物的研究，初步确定了地黄内生真菌的种群结构，为研究其内生真菌的多样性提供一些理论依据；筛选出一株产梓醇的活性菌株，并确定了适合其的最优发酵工艺；通过诱变获得一株较稳定的高产突变菌株，为工业化快速生产梓醇奠定基础。