论文摘要
低温蛋白酶是指最适催化温度在40℃以下的一类蛋白水解酶,一般由嗜低温微生物或耐低温微生物产生。由于其最适催化温度接近自然环境中的温度,因此在应用过程中可省去加热和冷却过程,与中高温蛋白酶相比具有节能、省时等特点。本研究旨在从嗜低温微生物中筛选新型低温蛋白酶,研究分析其酶学性质,并对编码基因进行克隆与表达方面的研究。具体研究工作包括如下4个方面：(1)从南印度洋的深海沉积物中分离到一株嗜低温动性球菌(Planococcus sp.11815),该菌株可以在0-4℃之间进行正常的生长代谢,并在20℃以下具有表达分泌低温蛋白酶的能力,经48h摇瓶发酵,蛋白酶产量可达280U/mL。酶学性质分析结果显示：该菌株所产蛋白酶的最适作用pH值为8.0,最适作用温度为37℃,当催化温度降至30℃时,酶活可保持在80%以上,并且在4℃条件下仍具有水解蛋白的能力。因此该菌株所产蛋白酶属于典型的低温碱性蛋白酶,具有一定的研究及开发价值。(2)通过设计简并性引物并采用反向PCR的方式从筛选获得的嗜低温动性球菌中分别克隆到两种蛋白酶编码基因：cpls8和cpls41,序列分析结果显示:cpls8所编码的蛋白属于丝氨酸蛋白酶中的S8家族,是一种胞内蛋白酶；而cpls41所编码蛋白属于S41家族,是一种分泌型蛋白酶。Blast比对结果显示：cpls8与cpls41基因所编码蛋白与目前数据库中已发表的蛋白酶序列的最高同源性分别为72%和76%,因此可确定为新型编码基因。(3)将cpls8基因克隆至表达型载体pET-22b上,并在大肠杆菌Rosseta (DE3)中实现了功能表达。重组蛋白酶CPLS8经分离纯化后,比酶活可达到32.68U/mg,其最适作用温度为37℃,最适pH为10.0,在45℃保温60min,则酶活完全丧失。Ca2+对该酶起促进作用,而EDTA等离子鳌合剂以及PMSF则对该酶有抑制作用。(4)将cpls41的编码基因分别克隆至融合表达载体pET-32a上,在E.coli RossetaDE3中实现了CPLS41的融合表达。经蛋白分离纯化、肠激酶处理去除融合蛋白后,CPLS41极不稳定,完全降解；进一步尝试将该基因在枯草芽孢杆菌WB600中进行分泌表达,未获成功。