论文摘要
Plastein反应又称为合成类反应或塑蛋白反应，是蛋白酶催化高浓度的蛋白水解物生成沉淀、触变胶体或者具有触变性粘稠胶状物的过程；Plastein反应可应用于提高蛋白质的营养价值和功能特性、补充限制性氨基酸和去除酶解液的苦味等。ACE抑制肽可以通过抑制血管紧张素转化酶Ⅰ（ACE）的活性降低血压，是用于治疗高血压的理想药物；近些年研究发现Plastein反应修饰可以提高蛋白酶解物的ACE抑制活性，是改善ACE抑制肽活性的新途径。Plastein反应是一个绿色的化学反应过程，具有很大应用价值和发展潜力。但是，由于反应过程复杂，反应机理尚未明确，限制了它在实际工业生产中的应用。本文以海地瓜蛋白酶解物为原料，利用Plastein反应修饰海地瓜酶解物中的ACE抑制肽，以改善其活性，并对Plastein反应机理进行研究。本文主要研究内容如下：1.利用Plastein反应修饰海地瓜酶解液中的ACE抑制肽，得到修饰肽的血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性与原酶解液活性相比，IC50值由0.44mg/mL降低到0.12mg/mL；用超滤、Sephadex G-15凝胶层析和RP-HPLC等分离技术纯化Plastein修饰产物，逐步提高ACE抑制肽的活性，鉴定所得肽的序列结构为NQNFVQYTTNT（IC50值3.67μmol/L），在肽库中检索没有发现相同序列，推测这可能是由Plastein反应合成的新肽；通过计算机辅助药物设计软件SYBYL模拟抑制肽与ACE活性区域的结合情况，确定了抑制肽与ACE的结合位点。2.以Plastein反应修饰的抑制肽为研究对象，研究修饰肽与ACE结合前后的紫外变化，推测修饰肽与ACE发生了有效结合；通过测定修饰产物对MDCK细胞的毒性，表明其浓度在10mg/mL的范围内对MDCK细胞没有毒性，且低浓度时还可以促进细胞生长；经胃肠蛋白酶模拟消化后ACE抑制活性是原来的1.56倍，说明修饰肽与胃肠蛋白酶作用后可以进一步增强其活性，是前体型药物；稳定性实验表明，ACE不影响修饰肽的降压活性。3. Plastein修饰产物的结构性质表征。通过红外光谱和圆二色谱分析，表明酶解物发生Plastein反应后有二级结构出现，如无规则卷曲和β-折叠等；热力学性质研究表明，Plastein反应可显著增加海地瓜酶解物的热稳定性，在分子内部和分子间形成较强作用力，使变性温度由129.86℃升高至134.18℃，焓变ΔH由酶解液的21.8J/g升高至79.7J/g；X-射线衍射结果表明，Plastein反应使物质原有的空间排布发生改变，形成了新的物质结构；扫描电镜结果表明，Plastein反应产物具有类似于完整蛋白质的空间结构，说明Plastein反应产物不同于酶解物，它包含较强的作用力并具有一定的空间结构。4. Plastein反应机理的研究。测定Plastein反应过程中游离氨基酸含量减少及封闭反应体系中游离氨基端和羧基端后Plastein反应产率下降，证明反应过程中发生了缩合反应；测定产物中大分子量物质没有增加，而游离氨基酸含量却减小，说明反应机理中包含转肽作用。缩合作用和转肽作用共同导致新的共价键生成，是Plastein反应应用于提高蛋白质或肽的功能性质方面的主要原因，也使海地瓜酶解液的ACE抑制活性经过Plastein反应修饰后提升。同时非共价键、疏水交互作用、氢键和离子键对形成Plastein修饰产物的结构具有重要作用；因此，海地瓜酶解液的Plastein反应包括在底物与酶相互作用下由缩合反应和转肽反应形成新的共价键，与非共价键参与的物理聚集等，共同形成了Plastein产物的胶状结构。