论文摘要
随着社会发展对能源的需求加剧，石化燃料日趋枯竭，同时环境污染形势日趋严峻，生物柴油作为石化柴油理想的替代品，近年来发展迅速，或将成为应用最广的环保可再生新能源。生物柴油规模化生产受到油脂原料供给不足以及油脂原料成本过高的制约。微藻种类繁多，生长迅速，容易培养，能够为生物柴油的生产制备提供充足、合格的原料保障。获取优良藻株并采用适宜的培养条件，促进微藻油脂产率的提升是解决油脂原料成本问题的关键。利用微藻自然絮凝沉降，简化生物量采收的操作，减少电能消耗，可进一步降低油脂原料的生产成本。由于单一采用生物量或含油量对微藻产油能力评价不全面，本研究采用油脂产率作为综合评价微藻油脂生产能力的标准。依据该评价标准，本实验从云南澄江抚仙湖水样中分离出一株微藻，通过18S rRNA序列比对并结合形态学特征，鉴定为小球藻Chlorella属，命名为Chlorella sp. U4341。建立了油脂提取方法，并改进了直接转酯化方法，采用通用培养基BG-11对Chlorella sp. U4341进行自养、异养及兼养培养的研究，通过对油脂产率及脂肪酸组成的考察，认为该微藻具备为生物柴油生产提供良好原料油脂的潜力，并具有进一步提升油脂产率及改善脂肪酸组成的空间。采用改进的Bold’s Basal培养基，Chlorella sp. U4341的生物量明显增加，油脂产率显著上升，运用响应面分析法-中心组合设计，对不同培养方式的培养条件进行优化，进一步提升油脂产率。在最佳培养条件下，自养培养的油脂产率为17.99mg L-1d-1，比优化前的油脂产率（14.77mg L-1d-1）提高了0.22倍，比采用BG-11培养基的油脂产率（16.63mg L-1d-1）提高了0.10倍。异养培养的油脂产率为273.34mg L-1d-1，比优化前的油脂产率（173.06mg L-1d-1）提高了0.58倍，比采用BG-11培养基的油脂产率（103.72mg L-1d-1）提高了1.64倍。兼养培养的油脂产率为280.57mg L-1d-1，比优化前的油脂产率（181.60mg L-1d-1）提高了0.54倍，比采用BG-11培养基的油脂产率（114.45mg L-1d-1）提高了1.45倍。相比较在通用培养基BG-11中生成的油脂，优化培养条件后生成的油脂中各脂肪酸组成得到了改善，单不饱和脂肪酸所占比重明显增加，多不饱和脂肪酸所占比重显著下降，在一定程度上提升了十六烷值。但油脂产率依旧不够理想，油脂中脂肪酸组成尚未达到生物柴油生产的标准，还需进一步改进培养方法。研究者们在微藻-细菌、微藻-酵母的共培养促进微藻油脂产率已经取得较好的成果。本研究利用微藻Chlorella sp. U4341具有相对高的生长速率和微藻Monoraphidium sp. FXY-10积累油脂能力突出的特点，对两株微藻进行共培养。共培养体系中的各藻细胞的不同浓度比例直接影响到总生物量、总含油量及油脂产率。调节各种微藻之间的浓度比例进行接种，是控制共培养体系中不同微藻细胞浓度比例的较为方便的手段。依据获得油脂产率的能力，在自养、异养、兼养培养方式下，选择U4341和FXY-10的初始浓度分别为3.41×106和4.26×106细胞mL-1；1.83×106和3.50×106细胞mL-1；1.83×106和1.98×106细胞mL-1进行共培养。在共培养体系中藻细胞生长受到不同程度的抑制，总生物量均小于单独培养。硝酸盐的消耗速度相比单独培养中有明显加快，氮源限制提前到来，使生长提前进入稳定期，缩短了培养的时间。在自养培养中，共培养的时间由单独培养的26天缩短为20天。异养与兼养培养中，由6天及10天缩短为5天。共培养体系促进了油脂总产量的提高以及培养时间的缩短，提升了油脂产率。自养、异养及兼养培养方式下，油脂产率分别为29.63mg L-1d-1、315.60mg L-1d-1、293.23mg L-1d-1。油脂产率的增加是多种因素综合作用的结果，两株藻之间的相互作用和营养缺乏特别是氮胁迫的生长条件也许是共培养体系中油脂产率提高的重要因素。共培养体系改善了脂肪酸的组成，显著增加了C18:1脂肪酸的含量，提升了油脂的品质。在兼顾冷滤点（-2.89至-6.64）具有较好的低温流动性的情况下，增加了十六烷值。在异养及兼养培养方式下油脂的十六烷值分别为52.26和49.04，达到我国的生物柴油生产标准。微藻细胞自絮凝沉降简化了技术路线，便于生物量的采收，有利于降低生产成本。沉降环境中的光线照射影响较大，沉降环境中有光照，阻碍了藻细胞的附聚能力，导致藻细胞沉降率下降。为了提高沉降率，采用在避光的黑暗环境中进行沉降试验。共培养体系比单独培养体系更能加速藻细胞的沉降率，8小时内，沉降率达到90%以上。在沉降过程中，发现自养培养中主要是U4341发生细胞聚集，异养培养中主要是FXY-10发生细胞聚集，在兼养培养中藻U4341和藻FXY-10细胞均出现膨大，并发生聚集。共培养中微藻细胞聚集形成絮凝，加速沉降是多种因素综合作用的结果，单纯的pH值增高对藻细胞的沉降率有一定的影响，胞外聚合物浓度的增加是主要影响因素。