论文摘要
随着放射医学在临床诊疗应用的推广和普及以及核电事业的发展,人们受到的辐射危害也逐渐增加。虽近年来人们对辐射生物学效应研究逐年增多，但主要集中在高剂量辐射，对低剂量辐射关注较少，这使得人们对低剂量辐射效应缺乏足够的了解和科学的认识。低剂量辐射虽不会对机体造成明显的伤害，但并不意味着低剂量辐射对机体没有危害。辐射可对机体多种组织器官造成损伤，如骨髓的造血组织，消化系统的肝脏及免疫系统的脾脏，它们均对辐射较为敏感。既往研究显示辐射可导致骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cell，BMNC）DNA受损，凋亡率增加，骨髓增殖能力降低，使骨髓造血干细胞数量迅速减少，最终导致血液系统疾病的发生，如白血病。同时辐射也可导致肝脏的损伤[1]。Gridley等人研究同样发现无论何种类型辐射都会导致免疫力下降及脾脏细胞的异常[2]。表观遗传学是指不涉及DNA序列改变的基因表达变化。它的主要调控方式包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑和非编码RNA等。目前人们关注较多的是DNA甲基化，DNA甲基化是指由DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）催化，将活性甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移至胞嘧啶，从而使胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的化学反应过程。DNA甲基化发生在胞嘧啶残基，主要是胞嘧啶-磷酸二酯-鸟嘌呤（cytosine-phosphate diester-guanine，CpG）二核苷酸部位，哺乳动物体内的CpG以两种形式存在，一种是分散于DNA中，另一种是位于转录调控区附近的CpG岛。它不仅可稳定或锁定静息部位染色体的状态，还对基因印记、X染色体失活、反转录转座子的抑制以及动物的正常发育都是必不可少的。1989年，Kalinich等人的研究发现射线可使一些细胞系的甲基化胞嘧啶还原为胞嘧啶[3]。1998年，Tawa等人同样报道辐射可导致体内外全基因组甲基化程度的降低[4]。2013年，Antwih等人报道辐射可影响细胞DNA甲基化[5]。但是以上研究均采用的是高剂量辐射，低剂量辐射与DNA甲基化效应仍不清楚。2004年，Kovalchuk等人的研究发现低剂量辐射可导致DNA甲基化水平的改变，且具有组织特异性和器官特异性[6]，但有关低剂量辐射对DNA甲基化影响的研究报道仍相对较少，其与DNA甲基化的关系并不十分清楚。本研究拟通过观察低剂量辐射对小鼠骨髓、肝脏和脾脏生物学效应的影响，尤其是DNA甲基化的影响，为辐射防护提供新的研究思路。目的：研究低剂量辐射对急性放射损伤小鼠外周血计数，BMNC增殖能力与凋亡率，肝、脾组织学结构，脾指数，肝、脾及BMNC全基因组DNA甲基化水平及DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase,DNMTs）表达的影响，进而观察急性低剂量辐射对小鼠生物学效应的影响。方法：1.将C57BL/6小鼠随机分为5组，每组25只，正常组（不做任何处理）；辐射组（按辐射后提取标本时间分为1、3、7及14d组）。辐射组采用直线加速器全身均匀照射，总剂量为1.0Gy,时间为0.39min，X射线吸收剂量率为300cGy/min，有效面积为25cm2,焦点-鼠距为100cm。并于不同时间点眼眶取血，取血后颈椎脱臼处死小鼠,常规方法提取BMNC、肝脏及脾脏。2.常规进行外周血WBC,RBC及PLT计数。3.CCK8法检测BMNC增殖能力。4.流式细胞术检测BMNC凋亡率。5.制备肝脏组织学切片并光学显微镜观察。6.计算脾指数及制备脾脏组织学切片并光学显微镜观察。7.高效液相色谱仪检测肝、脾及BMNC全基因组DNA甲基化水平。8.WB（western blot）检测BMNC DNMT1、DNMT3A及DNMT3B的表达。9.WB检测肝脏DNMT1、DNMT3A及DNMT3B的表达。10.WB检测脾脏DNMT1、DNMT3A及DNMT3B的表达。结果：1.与正常组相比，辐射组小鼠毛发光泽、活动度、食量及饮水量均与正常小鼠无异，大便无异常，14d内无小鼠死亡。2.与正常组相比，辐射组白细胞及血小板计数均明显降低（P<0.05），白细胞在1d时降至最低，而血小板在3d时降至最低，14d仍未恢复正常。3.与正常组相比，辐射组小鼠BMNC增殖能力升高（P<0.05），14d时恢复正常。4.与正常组相比，辐射组小鼠BMNC凋亡率3d开始升高（P<0.05），14d恢复正常。5.光镜结果显示，与正常组相比，辐射组小鼠肝小叶结构完整，病变多发生在中央静脉附近，肝细胞水肿、空泡变，局部肝细胞坏死，少许细胞脂肪变，血窦被挤压变窄，尤以3d和7d时最为严重，14d略有好转，但未恢复至正常。6.与正常组相比，辐射组小鼠脾指数在1d时即显著降低，7d恢复正常。光镜结果显示，正常组小鼠脾脏白髓与红髓分界清楚，淋巴细胞排列紧密，辐射组小鼠脾脏出现淤血，部分小血管玻璃样变性，血管内皮细胞肿胀，尤以3d组最为严重，7d时逐渐好转，14d时恢复正常。7.与正常组相比，辐射组BMNC、肝及脾全基因组DNA甲基化水平下降（P<0.05），但BMNC和肝分别在14d及3d恢复正常,脾脏在14d仍未恢复正常。8.与正常组相比，辐射组BMNC DNMT1及DNMT3A表达显著升高（P<0.05），14d时仍未恢复至正常， DNMT3B的表达也显著升高（P<0.05），但在7d时已恢复至正常。9.与正常组相比，辐射组肝脏DNMT1及DNMT3A表达显著升高（P<0.05），14d时仍未恢复至正常。DNMT3B的表达也显著升高（P<0.05），但在7d时已恢复至正常。10.与正常组相比，辐射组脾脏DNMT1及DNMT3A表达显著降低（P<0.05），DNMT3B未检测出，DNMT114d时仍未恢复正常，DNMT3A在7d时已恢复至正常。结论：1）单次1Gy x射线照射可导致小鼠BMNC凋亡率及增殖能力的增高，全基因组DNA甲基化水平的降低及DNA甲基转移酶表达的升高。2）单次1Gy x射线照射可导致小鼠肝脏和脾脏组织学结构的紊乱，肝脏和脾脏全基因组DNA甲基化水平的降低及DNA甲基转移酶表达的紊乱，且DNA甲基转移酶表达的改变具有组织和器官特异性。