论文摘要
目的观察组蛋白去甲基化酶抑制剂反苯环丙胺(tranylcypromine,TCP)对CD4+T细胞Th1/Th2分化的影响,分析赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(Lysine-specific demethylase1, LSD1)在其中的作用,探讨TCP在调控Th1/Th2分化平衡中的作用及机制。方法1.收集并分离22例健康人外周血单核细胞,免疫磁珠法纯化CD4+T细胞,经抗CD3单抗联合抗CD28单抗刺激活化后,加入不同浓度TCP(10、30、50、80、100nM)作用,用CFSE法检测细胞增殖能力：Annexin/PI流式细胞术检测细胞凋亡率：CD4-PerCP-Cy5.5/IFN-γ-FITC/IL-4-PE三色流式细胞术检测细胞内细胞因子IFN-γ、IL-4的表达情况；用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR (RQ-PCR)检测不同浓度TCP对CD4+T细胞IFN-γ、IL-4、T-bet mRNA表达的影响；ELISA检测IFN-γ的含量；Western blot观察T-bet、STAT1、pSTATl蛋白表达情况。向极化培养的Th1细胞和Th2细胞中分别加入不同浓度TCP,用三色流式细胞术检测细胞内细胞因子IFN-γ、IL-4的的表达情况;Western blot检测STAT1、pSTAT1蛋白表达情况。2.应用不同浓度的TCP(10、30、50、80、100μM)和LSD1特异性短片断发夹RNA (shRNA)处理CD4-T细胞,用Western blot检测LSD1、双甲基组蛋白H3赖氨酸4(H3K4me2)、T-bet、STAT1和pSTAT1的蛋白表达情况。用实时荧光定量PCR (RQ-PCR)检测TCP(30μM)、shLSD1对T细胞IFN-γ、T-bet mRNA的表达。结果1.TCP对T淋巴细胞增殖凋亡等生物学功能产生影响。抗CD3单抗联合抗CD28单抗共刺激活化的CD4+T细胞经过TCP处理后,细胞增殖能力受到抑制,且TCP对增殖的抑制作用随着浓度的增加,抑制效果增强,尤其在浓度大于10μM的情况下,抑制作用显著(p<0.01)；细胞凋亡率显著增高(p<0.05),呈现浓度依赖性效应关系,药物浓度为100gM时细胞凋亡率达到高峰(p<0.001)。2.不同浓度TCP作用下细胞因子格局发生改变。应用流式细胞术检测,不同浓度TCP实验组IFN-γ阳性细胞频率均高于对照组,随着浓度的增加,IFN-y阳性细胞频率增加显著(p<0.05)。RT-PCR检测显示：10μMTCP组比未给药组IFN-γ mRNA提高了4倍,随着给药浓度增高,IFN-ymRNA表达随之增高,100μM TCP组IFN-γ mRNA表达达到高峰(p<0.001),比未给药组I]FN-γ mRNA提高了18倍。ELISA测定培养上清中IFN-γ的水平明显高于对照组(p<0.001)。3.TCP对T-bet/STAT1信号转导通路产生影响。应用RT-PCR和Western blotting分析发现,与对照组相比,Thl型特异转录因子T-bet表达明显增加,上游调控因子STAT1磷酸化(pSTAT1)程度显著增加。随着给药浓度增高,T-bet mRNA表达随之增高,100μM TCP组T-bet mRNA表达达到高峰(p<0.001),比未给药组T-bet mRNA提高了10倍。不同浓度TCP作用的极化培养Th2细胞中pSTATΓ的表达显著增加(p<0.05)。4.干扰LSD1表达引起Thl型相关细胞因子及调控子表达的改变。LSD1特异性化学抑制剂TCP作用T淋巴细胞引起H3K4me2表达增加。LSD1shRNA转染CD4+T细胞可下调LSD1表达,引起H3K4me2IFN-γ、T-bet、pSTAT1表达增加。结论TCP可调控CD4+T细胞分化向Th1型漂移,其机制可能是抑制了LSD1的活性。