论文摘要
酪胺是生物胺的一种,通过微生物对食品中游离酪氨酸的脱羧基作用形成。由于其含量变化可以客观地反映肉类腐败变质进程,因此它可以作为评价肉类新鲜度及腐败品质变化的重要指标。本文建立了一种具有高特异性的酶联免疫方法(ELISA)来检测食品中的酪胺。采用甲醛法和戊二醛法,将酪胺分别与牛血清白蛋白、卵清蛋白偶联,成功制备了酪胺的免疫原与包被原。通过免疫新西兰大耳白兔得到高效价的特异性抗血清,使用Protein A Sepharose-4B亲和层析法纯化抗血清得到酪胺多克隆抗体。本研究建立了间接竞争酶联免疫检测方法,对影响实验的各因素(包被原包被量,抗体稀释度,羊抗兔HRP标记二抗稀释度,封闭液等)进行了优化与筛选,最终确定包被原包被量为0.1μg/孔,抗体稀释度为1：500,羊抗兔HRP标记二抗的稀释度为1：15000,封闭液为0.5%乳粉/PBS溶液,抗体与标准品的孵育温度为25℃,在此工作条件下所获得的标准曲线灵敏度最高,稳定性最好。本研究所建立方法的灵敏度(IC50)为0.20±0.015mg/L,检测限(IC15)为0.02±0.004mg/L。所制备的抗体具有良好的特异性,与酪氨酸、苯乙胺、组胺、色胺均无交叉反应。本研究通过对样品前处理条件的优化,消除了样品基质影响,得到一种简单可行的样品处理方法,并将建立的方法应用于猪肉、牛肉、鱿鱼、鳕鱼中酪胺的检测,样品检出限是1.20mg/kg。当酪胺标准品的添加浓度为12,24,60mg/kg时,所有样品的回收率在80.71-101.12%之间,且变异系数(n=3)均小于10%。所得结果与高效液相色谱法(HPLC)的检测值具有很好的一致性(R2=0.9893),这表明所建立的方法具有很好的准确性,本研究建立的酶联免疫方法成本低廉,操作简便,适合于食品中酪胺的快速检测。