论文摘要
目的：探讨甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对哈萨克族正常食管上皮细胞一般生物学及表观遗传学指标的改变,为哈萨克族食管癌的防治提供理论依据。方法：1联合消化法培养原代哈族食管上皮细胞,细胞形态学和角蛋白免疫组织化学法鉴定细胞。2SV40-T抗原基因转染原代培养的哈族正常食管上皮细胞,获得永生化细胞系,采用RT-PCR法检测SV40-T抗原基因在永生化细胞中的表达。3MTT法检测细胞增殖改变、流式细胞术检测细胞周期改变、AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡改变。4高效液相色谱法(HPLC)测定基因组DNA整体甲基化水平改变。5甲基化特异性聚合酶链(MSP)法检测P16、FHIT、LRRFIP1、ALDHIL1基因甲基化状态。6RT-PCR和Wersten Blot法检测p16、FHIT、LRRFIP1、ALDHIL1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因mRNA和蛋白表达。结果：(1)原代细胞培养8～10d后汇合成片,呈铺路石样生长,免疫组织化学法检测细胞角蛋白表达阳性；(2)通过转染SV40-T获得永生化哈族正常食管上皮细胞,细胞形态和结构保持完好；(3)染毒后各组细胞抑制率均高于对照组(0μg/ml)；各组细胞G0+G1期比例低于对照组,而S期和G2+M期均高于对照组；中、高浓度组细胞凋亡率与对照组相比升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)；(4)中、高浓度组细胞基因组整体DNA甲基化水平低于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)；(5)高浓度组细胞DNMT1含量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),各浓度组细胞DNMT1活性均高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)；各浓度组细胞DNMT3a含量及DNMT3a活性均高于对照组,差异均具有统计学意义(<0.05)；各浓度组细胞DNMT3b含量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),高浓度组细胞DNMT3b活性高于对照组,差异有统计学意义(<0.05)；(6)与对照组比较各浓度组细胞p16、FHIT、LRRFIP1基因甲基化状态没有改变；高浓度组细胞ALDH1L1基因有从部分甲基化向完全甲基化转变的趋势；(7)与对照组比较各浓度组细胞p16、FHIT、LRRFIP1、ALDHIL1、DNMT1、DNMT3α和DNMT3b mRNA及蛋白表达水平均升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论：(1)成功培养出原代哈族正常食管上皮细胞并建立了永生化哈族正常食管上皮细胞系。(2)MNNG抑制哈族正常食管上皮细胞增殖,将细胞周期阻滞在S期和G2+M期,并促进细胞凋亡。(3)MNNG可降低哈族正常食管上皮细胞基因组DNA整体甲基化水平,使ALDH1L1基因从部分甲基化向完全甲基化转变。(4)MNNG提高了DNMT1、DNMT3a和DNMT3b酶活性,为抑癌基因甲基化提供了基础。MNNG对哈萨克族食管正常上皮细胞一般生物学及表观遗传学指标有一定影响。