论文摘要
研究背景与目的恶性肿瘤是目前严重威胁人类健康的主要的疾病之一。随着对肿瘤研究的不断深入，其诊断和治疗手段有了很大的发展。但是，由于肿瘤复发和转移等基本问题没有得到解决，其治疗效果的提高并不明显，以至于肿瘤的复发率和病死率居高不下。新近的研究认为，肿瘤是由不同类型以及分化程度不同的肿瘤细胞组成的异质性组织，其中包含一小部分具有耐药性的肿瘤细胞(Drug-resistant cancer cells)，它们具有自我更新能力，侵袭和迁移能力，并且能够形成不同分化程度的肿瘤细胞，也有研究称其为肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)。耐药肿瘤细胞被认为是肿瘤复发和转移的根本原因。因此，针对耐药肿瘤细胞的靶向性治疗将使最终攻克肿瘤成为可能，受到了研究者的广泛关注。目前，针对肿瘤靶向性治疗的研究策略通常是通过化学连接的方法将不同的肿瘤靶向性配体(包括小分子物质、多肽、单克隆抗体和肿瘤特异性表面标志物)和抗肿瘤药物进行连接，或者采用纳米材料与抗肿瘤药物连接的方法，利用纳米材料的肿瘤组织透过性增强及滞留效应(EPR效应)，将化疗药物特异性地转运到肿瘤组织中而发挥抗肿瘤作用。然而，从目前的一些肿瘤靶向性治疗研究结果来看，由于在体内的反应性与体外试验条件下并不完全相同，且通过连接后各活性基团的功能可能发生改变。多数通过化学连接的抗肿瘤药物对肿瘤的靶向性并不强，且对耐药肿瘤细胞杀伤作用不显著，因此在体内的抗肿瘤效果往往都不太令人满意。本课题组前期的研究报道了具有近红外荧光特性的七甲川花菁类小分子化合物IR-780在体内对肿瘤组织具有特异性识别能力，包括在移植瘤模型和化学药物诱导成瘤的动物模型中对肿瘤组织均具有良好的靶向成像作用。IR-780是一种亲脂性小分子，能够选择性地在肿瘤细胞的线粒体中蓄积。本课题在前期的工作基础上，进一步研究IR-780对肿瘤细胞可能的杀伤作用，并探讨其相关机制。主要研究内容包括三部分：1、IR-780对肿瘤细胞的杀伤作用。体外通过与临床抗肿瘤药物5-Fu和ADM比较研究IR-780对肿瘤细胞的杀伤作用，以明确IR-780对肿瘤细胞的杀伤活性，进一步研究其对敏感肿瘤细胞的周期分布，自我更新能力，迁移能力和细胞凋亡的影响及其在动物荷瘤模型中的抗肿瘤作用。2、通过化疗药物联合无血清悬浮培养的方法分离并鉴定耐药肿瘤细胞。采用抗肿瘤药物ADM联合无血清悬浮培养的方法从人肿瘤细胞系A549中成功分离出了耐药的肿瘤细胞(A549/DR细胞)，并对其耐药性，细胞周期分布，迁移能力，自我更新能力及干细胞特异性标志物Sox2和Oct4的表达情况进行鉴定，以为后续研究提供细胞模型。3、应用A549/DR细胞模型研究IR-780对耐药肿瘤细胞的杀伤作用。通过与化疗药物5-Fu、ADM比较，体外研究IR-780对A549/DR细胞的杀伤作用以及对细胞自我更新能力和迁移能力的影响；通过建立动物荷瘤模型，观察IR-780对肿瘤复发和耐药肿瘤细胞二次成瘤能力的影响；进一步探讨IR-780对A549/DR细胞选择性蓄积能力，及其对耐药肿瘤细胞线粒体功能和细胞凋亡的影响。主要研究结果包括：1、检测了IR-780对A549、H460、HepG2、U251、MCF-7五种肿瘤细胞的半数致死剂量IC50，发现IR-780对肺癌细胞A549杀伤作用最为显著，并对细胞增殖周期，自我更新能力和迁移能力均有抑制作用，显著促进细胞凋亡。进一步观察到IR-780在较高浓度(20μM)时对常规抗肿瘤药物5-Fu和ADM耐药的肿瘤细胞也具有杀伤作用。本实验揭示IR-780在较高剂量下可对肿瘤细胞产生杀伤作用，特别是对耐药肿瘤细胞的杀伤具有潜在的意义。2、通过低剂量ADM联合无血清悬浮培养的方法从A549细胞系中分离出呈悬浮球生长的A549/DR细胞。经鉴定A549/DR细胞具有耐药肿瘤细胞的特征，包括：对5-Fu和ADM的耐药性显著增强，其中90.11%的细胞处于G1期，具有较强的自我更新能力和迁移能力，同时表达干细胞特异性标志物Oct4和Sox2。本实验为后续研究IR-780对耐药肿瘤细胞的杀伤作用提供了细胞模型。3、与化疗药物5-Fu和ADM比较，IR-780（20μM）对耐药肿瘤细胞A549/DR表现出更强的杀伤作用，且对A549/DR细胞的自我更新能力和迁移能力抑制作用更明显。在动物体内实验中进一步证明了IR-780对肿瘤生长的抑制作用比ADM和CTX更显著，并能够明显延缓肿瘤的复发，且IR-780治疗后的肿瘤细胞二次成瘤能力明显降低。通过机制探索，观察到IR-780在A549/DR细胞线粒体的蓄积比A549细胞更强，并通过影响线粒体功能，降低线粒体膜电位，提高细胞ROS的水平，促进耐药肿瘤细胞凋亡。结论：本课题在前期工作基础上通过体内外实验，进一步发现七甲川花菁类荧光小分子IR-780在较高剂量条件下对A549肿瘤细胞，特别是对其耐药细胞亚群A549/DR具有显著的杀伤作用，并揭示其通过影响线粒体功能，诱导细胞凋亡，为耐药肿瘤细胞的靶向治疗研究提供了参考和依据。