论文摘要
背景激素依赖性皮炎(HDD)是外用糖皮质激素(GC)在局部皮肤不规范应用引起的炎症性皮肤病,目前发病机制尚不清楚,临床亦无满意治疗方法。外用GC是激素依赖性皮炎产生的初始原因,因为GC是通过与胞内的糖皮质激素受体(GR)结合相互作用的,因此激素依赖性皮炎的发病机制显然与GC-GR间相互作用有关。研究发现,在激素依赖性皮炎发生的过程中存在着大量炎症细胞因子的释放,而炎症细胞因子的聚集、表达可能和多个信号传导通路活化有关,其中NF-κB/IκB信号通路对免疫和炎症反应的调节最受关注。同时研究发现,GR和NF-κB在对免疫应答和炎症反应的调控中是一对功能上相互拮抗的重要的转录调节因子,NF-κB可介导多种与免疫和炎症相关的细胞因子和介质的活化过程,而GR则可抑制NF-κB活化基因的表达。据此,我们推测：GR介导的NF-κB/IκB信号通路在调控激素依赖性皮炎的发生发展中可能发挥着核心作用。昆明山海棠(THH)是一种具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等作用的中药,广泛应用于各种过敏性疾病、自身免疫性疾病的治疗。近年来临床研究发现,昆明山海棠治疗激素依赖性皮炎取得较好的疗效,可以明显降低停药后的复发率,可是其具体作用机制不清。我们推测：昆明山海棠可能通过上述信号通路调控、抑制炎症细胞因子表达,起到抗炎、免疫调节的作用。本实验拟以激素依赖性皮炎豚鼠作为研究模型,以该模型炎症反应过程为研究主线,以GR、NF-κB为研究靶点,从信号通路转导层面,研究激素依赖性皮炎发生过程中GR、NF-κB及其上下游调控的细胞因子(IL1、IL-4、TNF-a)表达的变化和规律,为阐明激素依赖性皮炎的发生机理提供实验依据。以昆明山海棠为干预手段,对其抗炎及免疫调节作用机理进行初步探讨,为优化临床治疗方案提供实验依据。目的通过建立激素依赖性皮炎豚鼠模型,对GC/GR介导的NF-κB/IκB信号通路关键分子进行测定,初步探讨激素依赖性皮炎的发病分子机制。并观察昆明山海棠对激素依赖性皮炎豚鼠NF-κB/IκB信号通路的影响,为该药的临床应用提供实验依据。方法1.通过外用0.02%丙酸氯倍他索软膏建立激素依赖性皮炎动物模型。2.将36只豚鼠随机分成空白对照组、造模组(造模7d组,造模15d组,造模21d组,造模28d组)和GR阻断组,每组6只。4组造模组分别在造模第7天、第15天(停药)、21天(停药后6天)、28天(停药后13天)进行心脏穿刺取血,采用ELISA法测定血清IL-1、IL-4含量；取背部实验区皮肤组织,应用免疫组化法测定NF-κBp65、IκB蛋白表达水平,采用RT-PCR法检测GRmRNA、TNF-amRNA转录水平。观察这些指标在不同造模阶段的变化规律。3.GR阻断组在外用激素15d停药后,按20mg/kg体重皮下注射浓度为10g/L的RU486(米非司酮)油剂,1次/d,连续6d。第21d脱颈椎处死动物,取背部实验区皮肤组织,用SABC免疫组化技术检测NF-κB和ⅠKB的表达水平,并与同期处死的造模21d组的NF-κ、IκB的表达水平比较。观察GR阻断后对NF-κB和ⅠKB的表达的影响。4.48只豚鼠,随机抽取40只建立激素依赖性皮炎模型,将造模成功后的豚鼠模型随机分为5组,即模型组、小剂量昆明山海棠组、中剂量昆明山海棠组、大剂量昆明山海棠组和外用激素递减对照组。剩余8只豚鼠作为空白对照。空白组、模型组均外涂凡士林,每天涂抹1次；外用激素递减对照组：开始第1周用0.1%丁酸氢化可的松乳膏于造模区皮肤均匀涂抹,2次/d；第2周,1次/d；第3周,隔天1次；第4周,3天1次；小剂量昆明山海棠组、中剂量昆明山海棠组、大剂量昆明山海棠组分别按1ml/kg、2ml/kg、4ml/kg标准灌胃给药,每天1次。各组均用药4周后停药,5天后分别测定血清IL-1、IL-4含量；皮肤组织NF-κBp65、IκB蛋白表达水平及GRmRNA、TNF-αmRNA转录水平。观察不同干预条件下这些指标的变化。结果1.造模组与空白对照组比较,血清IL-1、IL-4在造模组中的7d组、15d组呈下降趋势,在停药后的21d组、28d组逐渐升高。其中28d组血清IL-1含量明显高于正常对照,差异有统计学意义(P<0.05)。2.造模组与空白对照组比较,皮肤组织NFκB的表达在造模组中的7d组、15d组呈下降趋势,在停药后的21d组明显升高,28d组略有下降,与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,皮肤组织ⅠK B在造模组中的7d组、15d组呈上升趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。在停药后的21d组、28d组逐渐下降,但表达量仍然高于空白对照组。3.GRa mRNA的表达在造模组中的7d组有所升高,随后呈下降趋势,直到停药后的28d组略有升高。其中15d组、21d组、28d组GRa mRNA表达明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,皮肤组织TNF-amRNA的表达在造模组中的7d组、15d组呈下降趋势,在停药后的21d组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。28d组逐渐下降,但表达量仍然高于空白对照组。4.GR阻断组与与空白组及同期的21d组比较,NNF-κBp65表达均明显增高,而Ⅰ K B均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。5.治疗四周后,与模型组比较,激素递减组与昆明山海棠组血清IL-1、IL-4、皮肤组织NF-κB、TNF-αmRNA均有不同程度下降。昆明山海棠组随着剂量的增加,抑制效果越明显,其中高剂量昆明山海棠组血清IL-1、IL-4、NF-κB、TNF-α mRNA表达明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,激素递减组与各昆明山海棠组,皮肤组织Ⅰ K B表达均有不同程度升高。其中激素递减组和高剂量昆明山海棠组可明显增加Ⅰ K B表达,差异有统计学意义(P<0.05)。6.治疗四周后,与模型组比较,激素递减组可明显降低皮肤组织GRa mRNA水平,差异有统计学意义(P<0.05)。各昆明山海棠组则对GRa mRNA水平没有明显影响(P>0.05)结论1.在激素依赖性皮炎豚鼠模型中,长时间外用强效GC,可降低涂药区皮肤组织GR水平,并可使GR在停药后仍较长时间维持低水平表达。GC可同时可激活ⅠK B,抑制NF-κB表达,抑制血清IL1、TNF-a等前炎症因子水平,从而抑制炎症的发生。2.进行GR阻断后,GR阻断组与同时期模型组对比研究发现,NF-κB的活性有明显增高,Ⅰ KB表达则明显减少。表明在激素依赖性皮炎情况下,GR减少可抑制ⅠKB的表达,增强NF-κB的活性表达,从而加重激素依赖性皮炎炎症状况。亦说明正常功能状态的GR可抑制NF-κB诱导的免疫和炎症相关基因的表达。由此推测：激素依赖性皮炎的发生与GR长时间的低水平表达,抑制ⅠKB表达,从而激活NF-κB/IκB通路有关。3.昆明山海棠能以浓度依赖方式抑制激素依赖性皮炎豚鼠血清IL-1、IL-4水平,抑制皮肤组织TNF-α mRNA水平,增加ⅠKB表达,抑制皮肤NF-κB的表达。对GRα mRNA水平没有明显影响。表明：昆明山海棠对激素依赖性皮炎的抗炎干预作用不通过GR介导,而可能是通过抑制TNF-α水平,激活ⅠKB表达,从而阻止NF-κB核移位,下调其转录调控的炎症因子表达而实现的。