论文摘要
目的：本实验运用血清药理学、细胞生物学、分子生物学等技术，通过在体和离体实验，从细胞和分子水平探讨补中益气汤对A549/DDP裸鼠移植瘤组织中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）细胞信号转导通路的干预以及影响肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP对顺铂的耐药的机制，为今后寻找中药补中益气汤干预肺癌顺铂耐药的有效靶点提供分子生物学实验依据，同时为丰富肺腺癌顺铂耐药病机与治法理论提供新的思路与方法。材料与方法：BALB/C裸鼠60只随机分为空白对照组、荷瘤对照组、顺铂组和补中益气汤高剂量+顺铂组（高联组）、补中益气汤中剂量+顺铂组（中联组）、补中益气汤低剂量+顺铂组（低联组），培养A549/DDP细胞，调整浓度为5×106mL-1，空白对照组裸鼠给予腹股沟皮下接种生理盐水0.2mL/只；其余组裸鼠予腹股沟皮下接种A549/DDP细胞悬液0.2mL/只。观察各组成瘤情况，待肉眼观察到移植瘤出现时，空白对照组、荷瘤对照组给予生理盐水灌胃0.5mL/只；顺铂组给予等量生理盐水灌胃的同时，腹腔注射顺铂2mg·kg-1；高联组、中联组、低联组分别给予高、中、低浓度的补中益气汤（98.5g· kg-1、49.3g·kg-1、24.6g·kg-1）灌胃，同时腹腔注射顺铂2mg·kg-1，每日一次，观察裸鼠的一般状态，14d后取瘤组织固定、切片，进行HE染色，观察病理形态学改变，免疫组织化学方法、real time PCR方法检测各组裸鼠移植瘤中PI3K、AKT、Bad、NF-κb、caspase-9、survivin、mTOR蛋白和mRNA的表达水平。40只SD清洁级大鼠，体重（200±20）g，随机分四组，空白对照组（给生理盐水2ml灌胃），补中益气汤高剂量组(给予高剂量补中益气汤13.13g·kg-1灌胃)，补中益气汤中剂量组(给予中剂量补中益气汤6.57g·kg-1灌胃)，补中益气汤低剂量组(给予低剂量补中益气汤3.29g·kg-1灌胃)，1次/d，连续3d，末次给药1h后，腹主动脉采血，制备补中益气汤含药血清。采用MTT法检测不同剂量补中益气汤含药血清对A549和A549/DDP细胞的增殖抑制效应，培养A549、A549/DDP两种细胞，分别分为含药血清高剂量组，含药血清中剂量组，含药血清低剂量组，对照血清组，用含10%高、中、低含药血清的DMED培养基培养，分别于12h、24h、48h、72h收集细胞进行MTT比色法检测，筛选最佳含药血清和作用时间；MTT法检测最佳含药血清与不同浓度顺铂联合应用对A549/DDP细胞的抑制率，观察对顺铂耐药的逆转作用和最佳含药血清作用下A549/DDP细胞对顺铂的敏感性变化，并计算最佳含药血清对A549/DDP细胞顺铂耐药的逆转倍数。培养A549/DDP细胞，将其分为对照血清组、最佳含药血清组、LY294002组、LY294002+最佳含药血清组（以下简称联合组），对照血清组加含有10%的SD大鼠对照血清的DMEM培养基，最佳含药血清组加含10%最佳含药血清的DMEM培养基，LY294002组在对照血清组的基础上加LY2940021μL培养基，LY294002+最佳含药血清组（联合组）在最佳含药血清组的基础上加LY2940021μL培养基，培养基为200μL，免疫细胞化学方法，免疫印记方法（Western Blotting），实时荧光定量聚合酶链反应(real time PCR)方法检测磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）的蛋白及mRNA的表达。培养A549和A549/DDP细胞，分为A549对照血清组、A549最佳含药血清组，A549/DDP对照血清组，A549/DDP最佳含药血清组，A549和A549/DDP对照血清组加含有10%SD大鼠对照血清的DMEM培养基，A549和A549/DDP最佳含药血清组加含有10%最佳含药血清的DMEM培养基，免疫细胞化学方法、Western Blotting、real time PCR方法检测PI3K/AKT细胞信号通路下游因子Bad、NF-κb、caspase-9的蛋白及mRNA的表达。采用SPSS16.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差表示，各组数据符合正态分布，方差齐时，采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法；不符合参数检验者，采用多组剂量资料秩和检验。P＜0.05有统计学意义。结果：1补中益气汤联合顺铂可降低移植瘤体积，中联组和高联组的抑瘤率与顺铂组比较，差异有统计学意义。2HE染色观察各组裸鼠移植瘤病理改变发现：荷瘤对照组的切片呈现明显的肿瘤特征，细胞异型性和组织异型性明显，并可见到组织坏死，炎性细胞浸润，并伴有新生血管组织等，而在各治疗组，随着顺铂和不同剂量补中益气汤+顺铂的应用，肿瘤坏死组织多见，肿瘤细胞的密度降低，炎性细胞浸润较增多。3免疫组织化学方法、real time PCR方法技术检测各组移植瘤中PI3K/AKT细胞信号转导通路及其相关下游因子Bad、NF-κb、caspase-9、survivin、mTOR的蛋白及mRNA的表达发现：与荷瘤对照组比较，中联组和高联组PI3K、AKT、Bad、NF-κb、survivin、mTOR的蛋白和mRNA的表达明显减少（P<0.05），caspase-9的蛋白和mRNA的表达在荷瘤对照组中表达最少，在中联组和高联组的表达逐渐最多，与荷瘤对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），在顺铂组和低联组中的表达居中。除surviven、mTOR的mRNA外，中联组和高联组与顺铂组、低联组、荷瘤对照组比较，有统计学意义（P＜0.05），低联组、顺铂组、荷瘤对照组两两比较，无统计学差异（P＞0.05），各因子蛋白和mRNA的表达中联组和高联组比较，无统计学意义（P＞0.05）。4不同剂量补中益气汤含药血清对A549和A549/DDP细胞有生长抑制作用，高剂量的补中益气汤含药血清对A549和A549/DDP的抑制率大于中、低剂量的含药血清（P<0.05）。10%补中益气汤中剂量含药血清作用48h为最佳含药血清和最佳作用时间，可作为本实验后续作用剂量和作用时间。5MTT法测定最佳含药血清与顺铂联合作用时，A549/DDP对顺铂的耐药指数由7.35降为3.76；逆转倍数为2.46。6用免疫细胞化学方法、Western Blotting、real time PCR方法检测PI3K、AKT蛋白及mRNA的表达显示：LY294002组中PI3K和AKT蛋白的表达，与对照血清组比较，没有统计学差异（P>0.05），在最佳含药血清组和联合组中PI3K和AKT蛋白的表达明显减少，与对照血清组比较均有统计学意义（P<0.05）;mRNA结果表明，A549/DDP细胞中最佳含药血清组PI3K和AKT mRNA表达减少，与对照血清组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；LY294002组中PI3K、AKT mRNA表达与对照血清组比较，没有明显差异（P>0.05）；在联合组中PI3K、AKT的mRNA表达明显下降，与对照血清组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。7免疫细胞化学方法、Western Blotting、real time PCR方法检测Bad、NF-κb、caspase-9蛋白及mRNA表达显示：Bad、NF-κb两种蛋白在A549/DDP对照血清组中呈现高表达，强阳性，显著高于A549对照血清组的表达水平，两组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；A549/DDP最佳含药血清组中Bad、NF-κb两种蛋白有所下降，与A549/DDP对照血清组比较，其差异具有统计学意义（P<0.05），此表达与A549对照血清组表达水平接近，二者无统计学差异（P>0.05）；Bad、NF-κb两种蛋白在A549最佳含药血清组中的表达与A549对照血清组比较，差异无统计学意义（P>0.05），Bad、NF-κb的mRNA在各组中的表达趋势与其蛋白表达相一致。caspase-9蛋白在A549/DDP对照血清组中呈现出弱表达，弱阳性，显著低于A549对照血清组，二者比较，其差异有统计学意义（P<0.05）；A549/DDP最佳含药血清组中caspase-9蛋白的表达有所上升，与A549/DDP对照血清组比较，差异具有统计学意义（P<0.05），与A549对照血清组比较，无统计学差异（P>0.05）。结论：1补中益气汤与顺铂联合作用可抑制A549/DDP移植瘤的生长。2补中益气汤抑制A549/DDP移植瘤的作用是通过调节PI3K/AKT信号转导通路，促进细胞凋亡实现的。3补中益气汤含药血清对A549/DDP的生长有抑制作用，高剂量的抑制作用比中、低剂量明显。10%中剂量含药血清作用48小时可作为体外实验的最佳含药血清和最佳作用时间，补中益气汤含药血清可降低A549/DDP对顺铂的耐药性。4补中益气汤含药血清可降低PI3K，AKT及下游因子Bad、NF-κb蛋白及mRNA的表达，增加caspase-9蛋白及mRNA的表达。5补中益气汤含药血清可通过调节PI3K，AKT及下游因子Bad、NF-κb、caspase-9的表达实现其降低A549/DDP对顺铂的耐药性的作用。