论文摘要
中国水仙凝集素(NTL)具有很高的药用价值,据研究发现,植物凝集素具有多种药理活性,如对真菌、哺乳动物细胞的免疫调节活性、抗HIV-1型病毒活性、抗单纯疱疹病毒和巨细胞病毒等活性。但是,受原材料来源的限制,中国水仙凝集素产量不高。而利用原核生物表达中国水仙凝集素,重组蛋白多以包涵体形式存在,无生物活性,故本课题采用毕赤酵母表达重组中国水仙凝集素。本课题前期曾采用巴斯德毕赤酵母分泌表达NTL,虽然经过分离纯化后具有一定的凝血活性,但目的蛋白的产量也不能有效的测定,此外,与天然产物相比其凝血活性无明显差别。因此,不利于进行大规模的生产。本研究首先利用Balb/C小鼠自制了中国水仙凝集素的多克隆抗体以建立高效、快速的检测发酵液中重组中国水仙凝集素ELISA法。同时,确定了抗原包被量为每孔10μg,一抗稀释比例为1：1600,二抗稀释比例为1：150的这一最佳检测条件。然后,从实验室前期构建的GS115/pPIC9K-NTL1和GS115/pPIC9K-NTL2两株菌株中筛选出表达产量高、凝血效果好的GS115/pPIC9K-NTL2菌种作为基因工程菌株。利用摇瓶实验优化了毕赤酵母表达条件,使用无机盐培养基,在菌体生长阶段摇瓶装液比例控制在10%,初始接种量为5%,最适温度为30℃,最适pH值为4.5；在菌体诱导表达阶段最适温度为28℃,最适pH值为5.0,甲醇浓度为1%。同时,对比了三种诱导方式对目的蛋白表达量的影响,实验结果表明,双碳源交替刺激法可获得更高的目的蛋白产量和凝血活性。利用5L发酵罐进行发酵表达体系研究,基本条件选取摇瓶考察中的最适条件,研究了发酵过程中的菌体干重、甘油浓度、铵盐浓度的变化、重组中国水仙凝集素的浓度及凝血活性的变化。实验还比较了两种诱导策略在重组蛋白的表达量及凝血活性。最后,分别用中空纤维膜超滤和超滤浓缩对发酵液进行前期浓缩,倍数分别为10倍和58倍。同时,分别用分子筛层析和甘露聚糖亲和层析介质对浓缩产物进行进一步的分离纯化,获得的纯化倍数分别是13倍和30倍。最后,用Western-Blot对纯化蛋白进行了特异性鉴定,结果证实纯化产物即为重组中国水仙凝集素。