论文摘要
目的本研究通过观察藏药吉尔巴对自发型2型糖尿病小鼠VEGF、HIF-1、PKC-β等因子的抑制作用及对视网膜组织结构病理改变的影响,血糖水平的调节,探讨该药对糖尿病视网膜病变的改善作用,揭示其防治DR的作用机制。方法选用基因突变自然发病型db/db糖尿病小鼠,10周龄db/db小鼠72只,12只db/m型同性同窝瘦型小鼠为对照。于小鼠生长至18周龄时检测血糖及随机取db/db小鼠和db/m小鼠各2只取视网膜组织进行病理学检测观察小鼠视网膜病变的成模情况。采用随机方法将db/db小鼠分为6组：db/db组、吉尔巴高、中、低剂量组(1.50、0.75、0.38g/kg)、羟苯磺酸钙组(0.23g/kg)及小檗碱组(0.135g/kg),db/m组作对照。连续灌胃2个月,所有动物每2周称重1次,测血糖1次,并于灌胃2月末处死小鼠；摘眼球,行HE染色观察常规病理改变及进行视网膜消化铺片,观察微血管变化,计算周细胞／内皮细胞比值；应用实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测视网膜内VEGF、HIF-1、PKC-β基因和蛋白的表达,免疫组化观察三种因子在视网膜内的分布情况,观察藏药吉尔巴对自发性糖尿病小鼠视网膜病变的改善作用。结果1.通过血糖水平以及视网膜形态学(视网膜组织切片)对db/db小鼠进行模型评价,结果显示18周龄db/db组小鼠与db/m组比较,血糖明显升高(P<0.01)。视网膜组织切片结果显示18周龄db/db小鼠视网膜内组织水肿,视网膜节细胞肿胀,数目减少,内丛状层肿胀,毛细血管充血、扩张,内皮细胞增生,微血管壁增厚。自发性糖尿病小鼠(db/db小鼠)可以作为人类糖尿病视网膜病变的动物模型。2.藏药吉尔巴高剂量组小鼠从给药后2周较db/db组血糖明显下降(P<0.05)；给药6周后吉尔巴高低剂量组小鼠血糖显著下降(P<0.05),且吉尔巴低剂量组优于高剂量组。给药8周后,吉尔巴高中低剂量组小鼠血糖水平都有显著下降,且低剂量吉尔巴对DR模型小鼠的降糖作用随给药时间的延长而逐渐增强。3.视网膜病理学检测结果：db/m组小鼠视网膜各层组织排列规则,未见明显异常；db/db组小鼠视网膜组织内、外核层细胞排列紊乱,内核层明显变薄,视网膜神经节细胞数较db/m组明显减少；吉尔巴剂量组小鼠视网膜损伤较db/db组为轻,视网膜组织内外核层细胞排列较整齐,神经节细胞数、内外核层细胞数相对增多。4.视网膜组织形态学观察结果：db/db组小鼠视网膜毛细血管管径粗细不一,血管基底膜增厚,管壁增厚深染,血管走向极不规则,排列紊乱、甚至可见扭曲集结形成血管襻,可见白细胞栓塞毛细血管管腔,内皮细胞增生,周细胞明显减少。与db/m组相比,db/db组小鼠视网膜中E/P值显著升高(P<0.05),与db/db组相比,吉尔巴高剂量组小鼠视网膜中E/P值明显降低(P<0.05),具有统计学差异。5.免疫组化结果显示：db/m组小鼠视网膜内HIF-1α、PKC-β、VEGF免疫组化反应呈弱阳性,表达量低；db/db组PKC-β、VEGF免疫组化反应呈阳性,表达量高,与db/m组相比差异显著(P<0.01)；与db/db组比较,各给药组db/db小鼠视网膜组织HIF-1α表达无统计学意义,但给药组较db/db组比较都有一定降低趋势；吉尔巴高剂量组db/db小鼠视网膜组织PKC-β表达显著减少(P<0.01),吉尔巴低剂量组、小檗碱组小鼠视网膜组织VEGF表达显著降低(P<0.01)。6.蛋白表达结果显示：db/db组HIF-1α、PKC-β、VEGF蛋白表达明显高于db/m组,差异显著(P<0.05)；与db/db组比较,吉尔巴高剂量组可显著降低HIF-1α、PKC-β的蛋白表达(P<0.05),吉尔巴药物组VEGF表达较db/db组是下调的,差异不具有统计学意义。7.基因表达结果显示：与db/m组相比,db/db组HIF-1α、PKC-β、VEGFmRNA表达显著增加(P<0.01),吉尔巴高剂量组可显著降低PKC-β、VEGFmRNA表达(P<0.05),HIF-1α表达也是呈下降趋势,但差异不显著。结论自发性糖尿病小鼠(db/db小鼠)可以作为人类糖尿病性视网膜病变的动物模型。藏药吉尔巴对DR具有很好的防治作用,其作用机制可能是通过抑制HIF-1α、PKC-β、VEGF因子的表达,调控视网膜血管内皮细胞功能,改善自发性糖尿病小鼠视网膜微血管损害,保护视网膜毛细血管,阻止新生血管形成,并能缓解自发性糖尿病小鼠的体征及生存状态,提高其生存质量而实现的。