论文摘要
研究背景：肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,其中80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),确诊时约65%的患者已属晚期,无手术机会。吉西他滨等三代化疗药联合铂类组成的一线方案,可改善晚期NSCLC预后,但有效率仍只有20～40%,5年生存率不到15%,且已进入平台期,耐药性是化疗失败的重要原因。近年来研究显示,核苷酸切除修复互补基因1(excision repair cross complementation1, ERCC1)的表达水平与铂类疗效呈负相关,而核苷酸还原酶M1亚单位(ribonucleotide reductase Ml, RRM1)可能是导致吉西他滨耐药的关键靶点,RRMl低表达者更能从吉西他滨化疗中获益。目前定量分析RRMl和ERCClmRNA表达水平的研究还主要针对来源于纤支镜或肺穿刺活检以及手术获得的肿瘤组织,而针对细胞学已明确诊断,但没有足够组织标本的晚期NSCLC患者,尚未见到有效的检测方法。RRM1有2种研究较多的单核苷酸多态性RR37C>A和RR524T>C,但其对NSCLC患者个体化治疗疗效的预测及预后的判断目前且尚无一致性结果。胞苷脱氨酶(eytidine deaminase,CDA)是灭活吉西他滨的重要酶,研究发现3种CDA单核苷酸多态性CDA79A>C, CDA208G> A,CDA435C>T与吉西他滨耐药可能有关,但相关研究仍很少。有研究显示,DNA修复基因中X线修复交叉互补基因1(X-ray repair cross-complementing gene1, XRCC1)多态性对预测肺癌细胞对铂类药物的敏感性具有较高的临床价值。XRCC1Arg399Gln突变等位基因数的增加与患者的生存期降低可能具有相关性,更多的研究还需进一步的证实。目的：(1)采用肿瘤组织和外周血对照研究,重点探讨外周血RRM1和ERCC1mRNA表达水平与晚期NSCLC患者吉西他滨/卡铂疗效及预后的相关性,旨在对更多患者化疗方案的选择提供分子生物学依据。(2)探讨RRM1、CDA、XRCC1基因的单核苷酸多态性对晚期NSCLC患者吉西他滨联合卡铂化疗疗效的预测价值,为实现个体化治疗提供参考。方法：(1)随机收集49例接收吉西他滨/卡铂化疗方案的初治晚期NSCLC患者,应用实时荧光定量PCR技术检测肿瘤组织和外周血中RRM1、ERCC1mRNA表达水平,对照分析其与患者临床特征、吉西他滨/卡铂方案的化疗反应以及预后的关系。(2)随机收集63例接收吉西他滨/卡铂化疗方案的初治晚期NSCLC患者,应用高分辨熔解曲线(high-resolution melt, HRM)分析技术检测外周血中RR37C<A、 RR524T>C、CDA79A>C、CDA208G>A、CDA435C>T以及XRCC1Arg399Gln的基因多态性,分析其基因型与患者临床特征、吉西他滨/卡铂方案的化疗反应以及预后的关系。结果：1、(1)肿瘤组织和外周血中RRM1表达水平呈一定的正相关,而ERCC1无相关(rs=0.332,0.258；P=0.020,0.073)；肿瘤组织或外周血中RRM1和ERCC1表达有一定的相关性(rs=0.634,0.351；P<0.001,0.013)(2)肿瘤组织和外周血中RRM1、ERCC1基因表达在患者的性别、年龄、吸烟状态、体力状况PS评分及肿瘤临床分期和组织学类型分布中无统计学差异(P均>0.05)。(3)肿瘤组织RRM1和ERCC1低表达者、外周血RRM1低表达者均可获更高的化疗有效率(50.0%vs16.0%,54.2%vs12.0%,50.0%vs16.0%; P=0.012,0.002,0.012),更长的总生存期(18.5月vs12.0月,19.8月vs12.5月,18.5月vs13.0月；p=0.014,0.007,0.043)和无进展生存期(7.8月vs3.9月,5.8月vs3.8月,6.0月vs4.0月；p=0.016,0.008,0.044),肿瘤组织中RRM1、ERCC1或外周血RRMl低表达者与高表达者比较1年生存率(P<0.01,P<0.05,P<0.05)均有显著性差异；肿瘤组织ERCC1低表达者获得了更高的2年生存率(P<0.05)；外周血ERCC1表达水平与化疗疗效以及预后均无相关性(P均>0.05)。Cox回归分析发现肿瘤组织ERCC1表达水平是影响总生存期的独立因素。2、(1)63例肺癌患者中,RRM1-37共检测出三种基因型： C/C26例(41.3%)、C/A31例(49.2%)、A/A6例(9.5%)；RRM1-524共检测出三种基因型：T/T26例(41.3%)、C/T30例(47.6%)、C/C7例(11.1%)。CDA-79共检测出两种基因型：A/A51例(81.0%)、A/C12例(19.0%)；CDA-208只检测出一种基因型G/G；CDA-435共检测出三种基因型：T/T4例(6.3%)、C/T16例(25.4%)、C/C43例(68.3%)；XRCC1Arg399Gln共检测出三种基因型：G/G34例(54.0%)、G/A27例(42.9%)、A/A2例(3.2%)。(2)以上基因型以及联合分析结果均未发现在患者的性别、年龄、吸烟状态、体力状况PS评分及肿瘤临床分期和组织学类型的分布中有统计学差异,以及与1、2年生存率之间亦无统计学差异(P均>0.05)。(3)在RRM1基因中,携RR524C/T、524T/T基因型患者的化疗有效率分别为50.0%(15/30)、23.1%(6/26),两组间有统计学意义(χ2=4.308,P=0.038)；携C的等位基因(C/T+C/C)化疗有效率为48.6%(18/37),高于T/T野生型基因组(χ2=4.234,P=0.040),是后者的3.7倍(OR=3.747,95%CI=1.104～12.715)。进一步基因型联合分析发现,RR37AC-524CT基因型患者的化疗有效率为51.7%(15/29),高于其他患者的化疗有效率26.5%(9/34),(χ2=4.232,P=0.040),是后者的3倍(OR=2.988,95%CI=0.996～8.965)。其中RR37CC-524TT基因型化疗有效率为25%(6/24),与RR37AC-524CT基因型患者间有统计学意义(χ2=3.920,P=0.048)。=CDA-79、CDA-435、XRCC1Arg399Gln基因多态性与化疗疗效未见统计学差异(P均>0.05)(4)单因素分析发现,RRM1基因中,携524T等位基因(C/T+T/T)的患者的无疾病生存期显著少于524CC基因型患者(5.0月vs12.0月,Log-rank=4.584, p=0.032); RR37AC-RR524TT基因型患者的无疾病生存期亦少于其他患者(2.0月vs5.9月,Log-rank=18.490,p=0.000)；在CDA-435基因中,携C等位基因(C/T+C/C)的患者的无疾病生存期、总生存期均显著长于435TT基因型患者(6.0月vs3.0月,16.5月vs7.5月；Log-rank=6.275,4.171；p=0.012,0.041)。在XRCCl-399基因中,携G等位基因(A/G+G/G)的患者的总生存期显著长于399AA基因型患者(15.5月vs5.3月,Log-rank=15.557, p=0.000). Cox回归分析发现RR37AC-RR524TT、CDA-435携C等位基因均是影响无疾病生存期的独立因素(P=0.001,0.022),而只有XRCCl-399携G等位基因是影响总生存期的独立因素(P=0.040)。结论：(1)肿瘤组织和外周血中RRMl低表达的晚期NSCLC患者更能从吉西他滨/卡铂化疗中受益,而肿瘤组织ERCC1表达水平是预测疗效和判断预后的一个指标。但由于入组病例数偏少,仍需要通过扩大样本量,特别是临床随机对照试验来验证。(2)本研究建立的HRM分析技术可以对晚期NSCLC患者RRM1、CDA、XRCC1进行精确的的基因分型；RR524T>C、CDA-435携C等位基因、XRCC1-399携G等位基因的晚期NSCLC患者可能会从吉西他滨/卡铂化疗中受益,但由于入组病例数偏少,实验结果还有待更大样本的研究证实。