论文摘要
不同物种在商品价值、品质、潜在过敏原种类和受保护程度等方面存在较大的差异，因此亟需建立一种简单、快速、可靠、重复性高的检测方法来保障消费者的权益、规范食品市场和保护濒危物种。目前分子学鉴定方法能够准确的区分不同目、科的物种，但对于同属的多个近缘物种的区分仍然面临巨大的挑战。本研究改进了传统的物种特异性PCR，设计多套中等特异性引物，通过综合分析几个PCR的结果来确定物种的身份。由中等特异性引物建立的多个PCR称为组合PCR。本文建立的组合PCR方法较传统物种特异性PCR的优势在于：对序列高度相似的近缘物种设计只扩增一个物种的引物是困难的，而组合PCR对引物特异性要求较低即允许引物扩增几个物种，因此引物设计相对容易；传统物种特异性PCR对假阴性、假阳性结果很敏感，而组合PCR中个别PCR结果出现假阴性或假阳性结果并不会对鉴定结果有本质的影响，仍然可以根据组合PCR的结果判断样本的疑似身份；组合PCR同时利用了多个目的片段，从多个角度反映样品身份，比传统的物种特异性PCR准确性更高；传统PCR鉴别物种时，所需的特异性引物数量一般等于甚至大于待区分物种的数量，而组合PCR中由于各PCR间交叉效果，其能够用相对较少的反应鉴别多个物种。本文选取金枪鱼属的所有金枪鱼（7种）为研究对象，设计中等特异性引物，建立组合PCR方法，并验证了该方法的实用性和准确性。首先，本文根据7种金枪鱼在NCBI中的序列信息，针对编码蛋白基因设计了6套中等特异性引物，并使用经过形态学鉴定的3种金枪鱼（长鳍、黄鳍、大目金枪鱼）的多个个体探索引物特异性发挥的合适条件。理论上使用5个PCR反应（共使用4套引物和3个反应条件）即可对5种金枪鱼身份进行准确区分，可将另外2种金枪鱼与其他金枪鱼分开。其次，根据一定条件下3种金枪鱼种内多个个体的PCR结果的一致性和对引物结合位点直接测序两种方法，对引物种内保守程度进行评价。两种评价结果均表明：实验所用的4套引物种内保守程度良好。虽少数个体的个别引物结合位置存在变异，但变异位于引物5端，对PCR结果影响基本可以忽略。再次，通过对真实样品的序列测定，总结了在特定条件下引物真实的区分模板的能力。同时结合没有实际样品的金枪鱼种的数据库中信息，得出能够鉴别7种金枪鱼的组合PCR模型（共使用4套引物）。结果表明：4套引物针对7种金枪鱼建立了6种组合PCR模型；长鳍和太平洋蓝鳍金枪鱼间序列的高度相似性，这两种鱼具有相同的PCR模型，本文针对金枪鱼建立的组合PCR方法尚不能区分它们。另外，本文利用上述方法鉴别市售的金枪鱼身份并对部分样品（未知样品和标准样品）测序建立基因树或SNP位点分析，结果表明：组合PCR鉴定结果和形态学鉴定、其他分子学方法鉴定的结果一致，从而验证了组合PCR结果检测的准确性。最后，本文建立了快速提取DNA的方法，所得DNA的完整性高。本文还对错配碱基种类、数目、聚合酶种类、引物模板比对引物区分能力的影响进行简单探索，这对组合PCR引物设计和条件优化有一定的参考价值。经过优化后的组合PCR方法更加简单、快速。综上所述，本文建立的组合PCR方法能够快速、准确的鉴别物种身份。虽然个别实际样品的部分序列与数据库中序列存在差异，但是随着dbSNP和NCBI数据库的完善，此方法可作为一个可靠的物种检测手段。对构建近缘物种鉴定体系，规范市场秩序、保护濒危物种具有重要意义。