论文摘要
目前，研究已证实乌贼墨多糖（SIP）是一类具有广泛生物学功能的海洋生物活性物质，可用于食品、保健及医疗等领域。本实验室研究人员长期致力于研究SIP的化疗预防作用，发现该功能具有广谱高效等特性，不仅能有效保护心、肺、肝、脾等内脏器官，也能降低环磷酰胺（CP）对睾丸的毒性损伤。本研究旨在探讨SIP干预CP介导睾丸氧化应激损伤的作用效果及其相关机理。首先，本实验通过酶提醇沉方法从乌贼墨中分离得到粗多糖样品，然后经柱层析纯化多糖样品，并测定纯多糖的纯度、分子量及红外分析。经分离纯化得到单一的洗脱多糖样品，该样品重均分子量为37068Da。纯度鉴定显示在260nm及280nm处无吸收峰，说明不含蛋白质及核酸等杂质。高效液相色谱图谱分析显示只有一个峰，且峰形较对称，峰宽较窄，说明该样品较纯。红外分析显示拥有多糖特征吸收峰和硫酸根基团特征吸收峰。60只健康的雄性昆明小白鼠，随机分为6组。实验周期10周，检测小鼠生殖器官指数、精子参数、睾丸组织切片及雄性生殖能力。实验结果显示CP能导致雄性生殖损伤，与前人研究结果相一致。CP组，小鼠体重、睾丸重量及附睾重量显著（p<0.01）降低，睾丸指数显著（p<0.05）下降，附睾指数差异不显著（p>0.05）；精子数、精子存活率显著（p<0.05）下降，各种畸形精子数及精子畸形率显著（p<0.05或p<0.01）提高；睾丸组织损伤严重，各阶段生精细胞数量减少，尤其是初级生精细胞，各曲细精管间间隙增加，睾丸间质细胞损伤，曲细精管直径显著（p<0.01）减小；雄性生殖能力下降，雌性小鼠受孕率降低，每窝胎儿数和活胎率显著（p<0.01）降低，死胎儿率显著（p<0.01）升高，畸形胎儿率变化不显著（p>0.05）。与模型组相比，SIP治疗组除在精子数、中尾折角精子数及畸形胎儿率无显著（p>0.05）改善，其他各指标都有明显改善（p<0.05或p<0.01），说明SIP能干预环磷酰胺介导睾丸生殖损伤的作用效果。40只健康的雄性昆明小白鼠，随机分为4组，空白组、模型组、乌贼墨多糖组、治疗组。实验周期10周，处死小鼠，检测睾丸组织中标志性酶活力、血清中性激素水平及氧化应激损伤等相关指标。实验结果显示与模型组相比，SIP显著（p<0.05或p<0.01）改善CP导致睾丸中标志性酶活力的异常变化，如LDH活力显著（p<0.05）上升，AKP、ACP及γ-GT活力显著（p<0.05或p<0.01）下降，且LDH、ACP及γ-GT活力与空白组无显著（p>0.05）差异；改善CP介导血清及睾丸中性激素水平的异常变化，血清中FSH、E和LH水平显著（p<0.05或p<0.01）降低，血清及睾丸中T水平显著（p<0.01）提高；缓解CP导致雄性小白鼠睾丸组织氧化应激损伤，如环磷酰胺处理组MDA及NO含量显著（p<0.01）升高，抗氧化酶SOD、CAT、GR、GSH-PX及二相解毒酶GST活力显著（p<0.01）下降，抗氧化剂GSH及Vc含量显著（p<0.01）下降，总抗氧化能力显著（p<0.01）降低，即说明SIP能显著（p<0.05或p<0.01）提高抗氧化酶活力及抗氧化剂含量，降低MDA及NO含量，缓解睾丸组织氧化应激损伤。40只健康的雄性昆明小白鼠，分组处理如上。实验周期10周，处死小鼠，提取睾丸组织中总蛋白。采用蛋白质印记分析睾丸组织中与氧化应激Nrf2/ARE信号通路相关的调控基因及下游目的基因相关蛋白的表达水平。结果显示与空白组相比，CP组Nrf2，Keap1和NQO1表达水平明显（p<0.05或p<0.01）降低，HO-1，HDAC2和p-PKC表达水平无显著（p>0.05）改变，SIP显著（p<0.05或p<0.01）提高Nrf2、NQO1、HO-1、Keap1、HDAC2及p-PKC表达水平。与模型组相比，SIP显著（p<0.01）缓解CP导致Nrf2、Keap1、NQO1表达水平的降低，说明SIP能通过激活Nrf2/ARE信号通路来缓解CP导致睾丸氧化应激损伤，且Keap1，HDAC2及p-PKC参与调控Nrf2/ARE信号通路。SIP能有效地缓解CP导致雄性生殖损伤的作用。其缓解机制与它改善睾丸组织标志性酶活力和氧化还原的稳态，及维持血清及睾丸组织中性激素水平平衡有关。另外，SIP的抗氧化作用在它缓解CP导致雄性生殖损伤方面起到重要作用，一方面它作为强的抗氧化剂，可以直接清除睾丸内因CP作用产生的过量活性氧自由基，维持睾丸组织氧化还原的稳态；另一方面它作为氧化诱导剂，间接激活Nrf2/ARE信号通路，促进下游抗氧化酶及二相解毒酶等蛋白表达，来抵抗外界不利因素。其中它能通过氧化Keap1上巯基调控激活Nrf2/ARE信号通路。另外，它能提高HDAC2与p-PKC的表达量，通过HDAC2的去乙酰化与p-PKC的磷酸化维持Nrf2蛋白的稳定性。p-PKC还介导Nrf2的进核机制。