论文摘要
海参硫酸多糖是海参的重要生物活性物质之一，在体壁中含量约为7%-10%。包括海参岩藻聚糖硫酸酯（fucan from sea cucumber, SC-FUC）和岩藻糖基化海参硫酸软骨素（fucosylated chondroitin fulfate from sea cucumber, SC-CHS）2个组分。SC-CHS是一种带有类硫酸软骨素E支链且高度硫酸酯化的酸性黏多糖，具有抗凝血、抗血栓、抗肿瘤的生物活性。目前SC-CHS对胰岛素抵抗的改善作用鲜有报道。因此，本论文以冰岛刺参（Cusumaria frondosa）和海地瓜（Acaudina molpadioides）中提取的SC-CHS为研究对象，通过体外细胞实验深入研究Cf-CHS和Am-CHS改善胰岛素抵抗的作用机制，并通过加入抑制剂的方法加以验证；进一步通过动物实验验证其体内改善胰岛素抵抗的作用，并阐明其作用机制。主要研究结果如下：SC-CHS主要由葡萄糖醛酸、氨基半乳糖和海藻糖组成，不同种类海参中提取的SC-CHS结构存在较大差异。从冰岛刺参中提取的Cf-CHS三种糖摩尔比为1︰1.5︰1.16，硫酸酯基含量为30.07%，分子量为14.76kDa；从海地瓜中提取的Am-CHS三种糖摩尔比为1︰1.14︰1.55，硫酸酯基含量为27.81%，分子量为21.53kDa。采用TNF-α诱导方法建立了3T3-L1胰岛素抵抗脂肪细胞模型，研究了Cf-CHS和Am-CHS体外改善胰岛素抵抗的作用及机制。结果显示Cf-CHS和Am-CHS均能显著增强模型细胞在基础状态、胰岛素刺激状态细胞对葡萄糖的转运，且SC-CHS能增强RSG的药效，Am-CHS优于Cf-CHS。利用Western blot方法分析了PI3K/PKB胰岛素信号通路中关键基因和ERK的蛋白表达和磷酸化水平，结果显示Cf-CHS和Am-CHS对PI3K、PKB、GLUT4和ERK总蛋白表达无显著影响，但均能显著促进胰岛素刺激的PI3K/PKB通路中关键基因PI3K的p85调节亚基、PKB的Ser473位点和Thr308位点的磷酸化水平，增加细胞外膜GLUT4蛋白表达；此外Cf-CHS和Am-CHS均能显著促进ERK1/2的磷酸化水平。表明Cf-CHS和Am-CHS均能通过上凋PI3K/PKB胰岛素信号通路和激活ERK促进胰岛素抵抗模型细胞对葡萄糖的转运，改善胰岛素抵抗。进一步通过分别加入在PI3K抑制剂wortmannin、PKB抑制剂MK2206、ERK抑制剂U0126抑制剂的方法，对Cf-CHS和Am-CHS改善胰岛素抵抗的作用及机制进行验证。结果表明Cf-CHS和Am-CHS均能显著逆转3种抑制剂对模型细胞转运葡萄糖的抑制作用。Western blot结果显示，在wortmannin干预下，Cf-CHS和Am-CHS对p-p85PI3K表达均无显著影响，但显著促进了p-Ser473-PKB、p-Thr308-PKB、p-ERK1/2和m-GLUT4的表达；表明SC-CHS不是通过激活PI3K，而是通过激活PKB和ERK促进了GLUT4的跨膜转运。在MK2206干预下，Cf-CHS和Am-CHS均显著增加了p-Ser473-PKB、p-Thr308-PKB和m-GLUT4的表达；表明SC-CHS能通过上调PI3K/PKB信号通路促进GLUT4对葡萄糖转运。在U0126干预下，Cf-CHS和Am-CHS显著促进了p-ERK1/2和m-GLUT4的表达；表明SC-CHS还能通过激活ERK促进GLUT4的跨膜转运。提示Cf-CHS和Am-CHS均能通过上调PI3K/PKB胰岛素信号通路和通过激活ERK，促进GLUT4跨膜转运葡萄糖，改善胰岛素抵抗；而SC-CHS是跨过PI3K而直接激活PKB和ERK发挥作用的，即其作用靶基因是PKB和ERK，而非PI3K。进一步在体内水平上验证并Cf-CHS和Am-CHS改善胰岛素抵抗的作用。通过饲喂雄性C57BL/6J小鼠高脂高蔗糖饲料（high-fat high-sucrose diet, HFSD），建立了胰岛素抵抗小鼠模型。饲喂SC-CHS19w后发现，Cf-CHS和Am-CHS均能显著降低模型小鼠空腹血糖水平，提高葡萄糖耐受性，降低胰岛素水平和HOMA-IR值，增加QUICKI值，降低体重和脂肪重量，增加血清脂联素水平，降低血清抵抗素、瘦素和TNF-α含量；且SC-CHS能显著减弱RSG引起的体重增加和脂肪蓄积的副作用，并进一步协同促进其它趋势；Am-CHS优于Cf-CHS。提示Cf-CHS和Am-CHS能在体内有效地改善胰岛素抵抗。胰岛细胞分泌的胰岛素相对不足是胰岛素抵抗最主要的特征，而高糖诱导的胰岛细胞凋亡是胰岛素相对不足的最直接原因。线粒体通路是哺乳动物细胞凋亡发生的主要途径。为探究SC-CHS对胰岛素抵抗小鼠胰岛细胞凋亡的抑制作用，采用光学显微镜观察了SC-CHS对模型小鼠胰岛组织的显微结构的改变。结果显示Cf-CHS和Am-CHS均能显著降低HFSD对模型小鼠胰岛的衰退，小鼠胰岛形态恢复接近正常，周围的基膜和结缔组织清晰完整，说明Cf-CHS和Am-CHS均能有效地抑制胰岛细胞的凋亡。进一步对SC-CHS抑制胰岛细胞凋亡的分子机制进行深入研究，RT-PCR结果表明Cf-CHS和Am-CHS均能显著下调模型小鼠胰岛组织Bid、Bax、cytochrome c、caspase9和caspase3促凋亡基因的mRNA表达，上调Bcl-2和Bcl-xL抑凋亡基因的mRNA表达；Western blot结果进一不表明Cf-CHS和Am-CHS均能显著增加t-Bid、Bax、caspase9和cleaved-caspase3基因的蛋白表达，促进线粒体释放cytochrome c，抑制Bcl-2和Bcl-xL基因的蛋白表达；且与RSG复配使用效果更显著。提示Cf-CHS和Am-CHS能通过阻断线粒体通路抑制模型小鼠胰岛细胞的凋亡，从而起到改善胰岛素抵抗的作用。肌肉和脂肪组织是机体利用葡萄糖的主要靶器官，其中有75%以上的葡萄糖处理发生在肌肉中；PI3K/PKB胰岛素信号通路是葡萄糖转运进入细胞的主要途径。为探讨SC-CHS体内干预胰岛素抵抗和促进葡萄糖转运的机制，本文进一步用qRT-PCR和western blot法比较研究了SC-CHS对骨骼肌和脂肪组织中胰岛素介导的PI3K/PKB信号通路中关键基因mRNA和蛋白表达的影响。qRT-PCR结果显示Cf-CHS和Am-CHS均能显著促进模型小鼠骨胳肌IR、IRS-1、PI3K、PKB、GLUT4基因mRNA表达。Western blot结果表明Cf-CHS和Am-CHS对PI3K/PKB通路中关键基因总蛋白表达无显著影响，但均能显著促进模型小鼠骨胳肌p-Tyr-IR-β、p-Tyr612-IRS-1、p-p85-PI3K、p-Ser473-PKB、p-Thr308-PKB和m-GLUT4蛋白表达。Cf-CHS和Am-CHS对模型小鼠脂肪组织中PI3K/PKB信号通路中关键基因的表达与骨胳肌中的趋势一致致，并能显著抑制p-Ser308-IRS-1蛋白表达。提示Cf-CHS和Am-CHS对均能激活模型小鼠肌肉和脂肪组织PI3K/PKB胰岛素信号通路，促进GLUT4对葡萄糖的跨膜转运，起到降低血糖和改善胰岛素抵抗的作用。葡萄糖代谢直接关系着机体葡萄糖的稳态，而糖原合成是胰岛素处理葡萄糖的另一重要途径。探讨SC-CHS体内对葡萄糖代谢和糖原合成的影响，本文进一步测定了SC-CHS对胰岛素抵抗模型小鼠肝脏糖原含量、糖原合成相关酶己糖激酶（hexokinase,HK）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase, PK）、糖异生相关酶糖原磷酸化酶（glycogenphosphorylase, GP）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase, G6Pase）的活力，并采用qRT-PCR法研究了SC-CHS对小鼠肝脏组织糖原合成的PKB/GSK-3β通路中关键基因mRNA表达的影响。结果显示Cf-CHS和Am-CHS均能显著增加胰岛素抵抗小鼠肝脏糖原的含量，提高糖原合成相关HK和PK的活力，降低糖异生PK和G6Pase的活力。qRT-PCR结果表明Cf-CHS和Am-CHS均能显著促进模型小鼠肝脏组织IR、IRS-2、PI3K、PKB、GS基因的mRNA表达，抑制糖原合成负性调节基因GSK-3β的mRNA表达。SC-CHS与RSG复配使用能进一步协同增加上述趋势，Am-CHS优于Cf-CHS。提示Cf-CHS和Am-CHS均能通过调节肝脏组织糖代谢相关的关键酶活力，并在转录水平上激活PKB/GSK-3β胰岛素信号通路，促进葡萄糖的代谢，增加糖原合成，起到降低血糖和改善胰岛素抵抗的作用。本论文首次通过体内和体外实验系统研究了SC-CHS改善胰岛素抵抗的作用，阐明了其分子机制；并首次报道了SC-CHS与RSG复配在进一步协同增加RSG药效的同时能减弱RSG的副作用。为推动SC-CHS在功能食品中的应用和低值海参的高值化加工利用，以及在药品中用SC-CHS部分替代RSG的应用提供了理论基础。