论文摘要
正常成年人的骨代谢是一个动态平衡的过程，包括成骨细胞进行的骨形成和破骨细胞进行的骨吸收。当此平衡失调，骨吸收大于骨形成时，即导致骨质疏松。鱼卵中含有丰富的蛋白质、EPA、DHA、维生素和矿物质等营养成分，具有防治心血管疾病、改善学习能力、促进儿童的生长发育等多种功效。鱼卵作为主要加工副产物，对其研究主要集中于其功能脂质的开发和利用，且对鱼卵糖蛋白的研究还集中于其分离纯化、生化特性等方面，对其活性研究甚少。因此本实验从鲫鱼鱼卵中经脱脂、水提获得水溶性唾液酸糖蛋白，从细胞水平系统的研究了鲫鱼卵唾液酸糖蛋白（Carassius auratus sialyglycoproteins，Ca-SGP）促进骨形成和抑制骨吸收功能的作用及机制，主要研究结果如下：采用DAD/FLD串联HPLC法检测不同水产动物水溶性糖蛋白的唾液酸含量，并用MC3T3-E1成骨细胞对其增殖活性进行追踪。结果显示，不同水产动物卵水溶性糖蛋白唾液酸含量与其促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖活性呈正相关关系，无脊椎动物鱿鱼卵中不含唾液酸，其水溶性糖蛋白对MC3T3-E1成骨细胞的增殖没有影响。其中鲫鱼卵水溶性糖蛋白中唾液酸含量最高，达3.76%，其促进MC3T3-E1成骨细胞增殖率也最大，400μg/mL时达153.57%，具有时间和剂量效应关系。故后续实验以鲫鱼卵唾液酸糖蛋白为研究对象。为了探究鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对MC3T3-E1成骨细胞活性的影响及其作用机制，本文将鲫鱼卵唾液酸糖蛋白经截留分子量为10KDa的中空纤维膜超滤分段，得分子量大于10KDa和小于10KDa的两个鲫鱼卵唾液酸糖蛋白，以MC3T3-E1成骨细胞为研究对象，采用MTT法研究了不同分子量Ca-SGP对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响，结果表明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均能显著促进MC3T3-E1成骨细胞的生长（96h时增殖率分别为153.57%和137.28%）；采用ELISA方法检测两种Ca-SGP对MC3T3-E1成骨细胞分化的影响，结果表明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均能显著促进成骨细胞分化关键蛋白ALP、OCN和COL I的分泌量，从而促进MC3T3-E1成骨细胞的分化；采用茜素红染色法检测不同分子量Ca-SGP对MC3T3-E1成骨细胞矿化的影响，结果表明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均对成骨细胞矿化结节的形成具有促进作用，分别提高了196.41%和158.37%（P<0.01）；采用RT-PCR和Western blotting法研究了两种Ca-SGP对MC3T3-E1成骨细胞骨形成关键基因BMP-2、OPG和RANKL mRNA和蛋白表达的影响，其中RANKL和OPG在调控破骨细胞分化中发挥重要作用，RANKL可促进破骨细胞的分化，而OPG可阻断RANKL的促进作用，从而抑制破骨细胞的分化，结果表明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均能显著上调BMP-2和OPG mRNA和蛋白的表达，下调RANKL mRNA和蛋白的表达。提示，Ca-SGP可能是通过提高OPG/RANKL的比值水平，而达到促进成骨细胞的分化及骨形成的功能，且Ca-SGP（>10KDa）的效果优于Ca-SGP（<10KDa）。为了进一步研究鲫鱼卵唾液酸糖蛋白对破骨细胞分化功能的影响及其作用机制，本文采用M-CSF和RANKL体外诱导小鼠骨髓细胞分化为成熟破骨细胞，建立破骨细胞模型，系统研究Ca-SGP对破骨细胞增殖和分化的影响并探究其作用机制。MTT法和LDH试剂盒法实验结果表明，两种Ca-SGP对破骨细胞前体细胞及破骨细胞增殖及细胞毒性均无显著性影响；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法及TRAP活性检测结果表明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均能够呈时间剂量依赖性的抑制小鼠骨髓造血细胞向破骨细胞的分化，且分化早期抑制作用最强；促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌量升高可促进破骨细胞的分化，ELISA法检测结果表明，>10KDa和<10KDa的Ca-SGP可显著抑制破骨细胞促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的合成。提示鲫鱼卵唾液酸糖蛋白具有抑制破骨细胞的分化及促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的作用，且与其细胞毒性无关。破骨细胞分化机制简单介绍如下：成骨细胞分泌的RANKL与破骨细胞表面的RANK结合，促进TRAF6与其在RANK上的结合位点结合，从而促进NF-κB、MAPK通路关键基因的激活，进而上调核转录因子c-fos和NFATc1的表达水平，此通路被激活后，引起破骨细胞分化关键基因TRAP、MMP-9、CTR、组织蛋白酶K的表达升高，从而介导破骨细胞的分化，因此成骨细胞对破骨细胞的调控至关重要。本实验研究结果表明，两种Ca-SGP均能抑制破骨细胞分化通路中TRAF6、NF-κB、MAPK（p38、ERK、JNK）和核转录因子c-fos、NFATc1以及TRAP、MMP-9、CTR、组织蛋白酶K的mRNA表达水平；且TRAF6、c-fos、NFATc1、TRAP、MMP-9、CTR、组织蛋白酶K的蛋白表达水平也显著降低，NF-κB以及MAPK（p38、ERK、JNK）蛋白磷酸化水平也明显下降。提示Ca-SGP可能通过抑制NF-κB/MAPK/NFATc1通路基因的表达而发挥抑制破骨细胞分化的作用，且与成骨细胞的调控息息相关。综上所述，鲫鱼卵唾液酸糖蛋白可显著促进成骨细胞的分化及骨形成功能、抑制破骨细胞的分化，其作用机制可能是通过上调MC3T3-E1成骨细胞中OPG的表达，下调RANKL的表达，从而抑制破骨细胞分化相关通路NF-κB/MAPK/NFATc1的激活。本文的研究结果为既安全又具有抗骨质疏松作用的药物的开发提供了理论基础，为鱼卵的高值化利用提供了科学依据。