论文摘要
糖胺聚糖在疾病中担任重要角色，因此，血清中糖胺聚糖结构、组成和含量的差异，可能是有用的诊断标志物。本研究旨在分析糖胺聚糖及其二糖在多种慢性肝病患者血清中的含量，以寻找灵敏、特异性强的诊断标志物。本论文首先通过优化酶解提取、阴离子交换层析、超滤离心脱盐等技术，建立了从血清中分离纯化微量糖胺聚糖的方法，并适用于质谱分析。总结了9种硫酸软骨素/透明质酸二糖的二级质谱裂解规律，然后，利用二级质谱结合所确定的特征碎片离子进行二糖的质谱定量，并和建立的AMAC-HPLC方法进行比较。以AMAC-HPLC定量分析了多种生物样本的硫酸软骨素二糖组成；通过此研究方法的应用，为进一步寻找新的疾病相关标志物，以及疾病的早期诊断治疗提供新的途径。本文内容如下：1.通过比较DEAE-Cellulose、DEAE-52、DEAE-Sephacel离子交换填料和Vivapure Ion Exchange离心层析柱对糖胺聚糖的分离纯化效果，确定采用Vivapure Ion Exchange离心层析法，其回收率高（76.6%），稳定性好，适用于微量糖胺聚糖的纯化。2.采用LC-ESI-QQQ方法初步分析了硫酸软骨素、透明质酸的二糖结构，推测了二糖的裂解规律，并确定了各二糖的特征碎片离子，选择丰度最高的特征碎片离子并优化其MRM质谱条件，以供定量分析。该方法根据二糖的硫酸化程度快速分离二糖，单次样品可在10min内完成分析。3.以2-氨基吖啶酮（AMAC）作为荧光衍生试剂，结合反相HPLC方法，用于生物样本中微量CS/HA二糖组成、定量分析，九种二糖可以实现基线分离，且多余的荧光试剂不影响二糖分析，省去柱前的纯化过程，简化了实验步骤。该方法的检出限为0.36ng，定量限为1.07ng，精密度RSD<4.6%。以二糖混合标准品对AMAC-HPLC和LC-ESI-QQQ两种定量方法的准确性进行了比较，两种方法均能准确定量目标组分，LC-ESI-QQQ方法前处理简便快速，AMAC-HPLC可以获得更全面的二糖组成信息。4.以AMAC-HPLC方法分析了大鼠脑组织、大鼠血清、健康人血清和胎牛血清四种生物样本的二糖组成，发现单硫酸根二糖4SCS总体含量较高，在大鼠脑组织、大鼠血清、健康人血清和胎牛血清四种样本中分别占到43.8%，29.4%，69.7%和83.0%。0SCS在大鼠血清最高，为60.3%；人血清其次，为14.1%；胎牛血清含量最低，为5.5%。血清样本中，高度硫酸化的CS二糖含量很低，三硫酸根二糖Tri SCS未检出，而大鼠脑组织中三硫酸根二糖Tri SCS的含量占到了16.9%，三种双硫酸根二糖SBCS、SECS、SDCS的含量分别为10.7%，8.8%和6.5%。血清和脑组织二糖组成差异较大；三种血清样品的二糖组成相近但比例不同。5.定量分析了健康、高血脂、非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌患者，以及乳清酸诱导脂肪肝大鼠（Wistar）血清中的CS/HA二糖。同健康人血清组相比，发现肝硬化组和肝细胞癌组中的单硫酸根二糖4SCS分别升高了（6%, P<0.05）和（7%, P<0.05）；透明质酸二糖0SHA分别升高（34.8%, P<0.05）和（36.3%,P<0.05）。与正常对照组相比，乳清酸模型组的软骨素二糖0SCS显著下降；与乳清酸模型组相比，海参皂苷组，脱硫皂苷组，皂苷苷元组及海星皂苷组的软骨素二糖0SCS不同程度升高；乳清酸模型组的软骨素二糖4SCS显著高于正常对照组，根据上述结果，推测4SCS、0SHA和0SCS三种二糖是肝病的潜在分子标志物。