论文摘要
本文从腐烂紫菜中筛选获得一株具有较强琼胶降解能力的菌株,该菌株在以琼胶为唯一碳源的初筛平板上培养2-3天后菌落周围形成明显的透明圈,培养4-5天后出现明显的平板液化现象,经36小时液体发酵培养,该菌株发酵液的琼胶酶活力达到33.6 U/mL。经16S rDNA鉴定该菌属于盐单胞菌属（Halomonas sp.）,将其命名为Halomonas sp. DT-3。对菌株Halomonas sp. DT-3分别采用紫外和化学诱变处理,通过选择性平板初筛和摇瓶发酵复筛,筛选获得一株高产琼胶酶突变菌株DT-3-57,经过多次分离纯化和遗传稳定性考察,该突变菌株发酵液的酶活力稳定在62.7 U/mL,产酶活力较原始菌株DT-3提高近一倍。通过比较诱变前后菌株产酶情况发现,紫外线处理对提高菌株产琼胶酶的作用效果不明显,DES化学诱变效果较好。通过单因素实验和正交实验,对菌株DT-3-57发酵产酶条件进行优化,确定了其最佳发酵产酶培养基组成为:琼胶0.5%,蛋白胨0.3%,酵母膏0.3%,CaCl2 1.0 mmol/L,NaCl 3.5%,K2HPO4 0.2 mmol/L,MgSO4 0.1mmol/L;最佳发酵条件为:起始pH 7.5,培养温度28℃,摇床转速120 rpm,接种量1%。在最佳发酵产酶条件下,菌株发酵产琼胶酶活力稳定在76.3 U/mL,比优化前提高了约21.7%,有利于进一步琼胶酶分离纯化及酶学性质研究实验的进行。采用80%饱和度的硫酸铵盐析提取发酵液中的粗酶,然后采用超滤浓缩以及Sephadex G-100凝胶过滤层析对粗酶进行纯化,最终将琼胶酶纯化了10.57倍,收率为30%。采用SDS-PAGE测定菌株产琼胶酶的分子量约为90KDa。对琼胶酶的理化性质研究表明,该酶反应的最适pH为7.0,最适温度为40℃,该酶作用的适宜琼胶底物浓度为0.7%-0.8%,在反应体系中添加适当浓度的Mg2+、K+、Ca2+、Ba2+离子对酶促反应均有不同程度的促进作用,其中Ca2+离子的效果最为显著。