论文摘要
水产品在养殖、腌制加工过程中普遍存在亚硝酸盐过量问题，具有一定的安全隐患，而乳酸菌是降解腌制食品中亚硝酸盐的最理想微生物。乳酸菌通过产亚硝酸盐还原酶来降解亚硝酸盐，而且能改善腌制食品的风味。因此，本研究从腌制食品中筛选出具有高效降解亚硝酸盐能力的乳酸菌，建立并优化复合乳酸菌降解亚硝酸盐的方法以应用于实际生产中。本研究的主要研究内容及结果如下：1、确定筛选高效降解亚硝酸盐的最佳时期实验以酸菜为菌种源，从发酵前、中、后期分别进行菌种筛选。根据不同时期筛选菌种的降解亚硝酸钠能力确定最佳筛选期。通过实验可知发酵中期，即“亚硝峰”出现的时期为最佳筛选期。此时，筛选菌种对亚硝酸盐（0.02g/100mL）的降解率最高可达80%。2、高效降解亚硝酸盐乳酸菌的鉴定对前期筛选的三株高效降解亚硝酸盐乳酸菌B1、C1、D2进行鉴定。经过全长16S rDNA基因的PCR扩增和测序，与NCBI上的标准序列作比对后，应用MEGA(version5.0)软件对结果使用Neighbour-Joining法构建系统进化树。最终确定三株菌分别为：戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)B1，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C1、D2。3、高效降解亚硝酸盐乳酸菌的紫外-亚硝基胍复合诱变通过15W紫外灯照射60s和0.5mg/mL亚硝基胍处理60min复合诱变降解亚硝酸盐戊糖乳杆菌B1、植物乳杆菌C1、D2。在含0.02%（g/mL）NaNO2的MRS培养基中37℃，培养24h后，亚硝酸盐降解率分别为81.5%、88.1%、91.4%，较初始菌株降解率分别提高了5.8%、8.0%和12.7%。4、高效降解亚硝酸盐乳酸菌产亚硝酸盐还原酶的提取及酶学性质研究用溶菌酶酶解（5mg/mL）结合超声破碎法(200W，超声5s，间歇10s，工作99次)，从降解亚硝酸盐能力最高的植物乳杆菌D2中提取亚硝酸盐还原酶，通过测定菌体在不同生长时期的产酶情况，确定菌体的产酶方式为延续合成型。酶的最适反应pH值为5.5，最适温度为35℃。在最适反应条件下，酶的Km值为20.7mmol/L，Vmax为30.7μg/min。利用酸碱沉淀法，测得酶的等电点约为4.0。经Sephadex G-75凝胶层析和SDS-PAGE凝胶电泳确定了该酶的分子量约为35.8kDa，属于铜型亚硝酸盐还原酶。5、复合菌种降解亚硝酸盐条件的优化利用正交法对复合菌种降解亚硝酸盐条件进行优化，得到最适反应条件为：菌种比例B1:C1:D2=1:2:1，发酵温度为35℃，混合菌添加量为5%(v/v)。该条件下，培养24h后亚硝酸盐(0.02g/100mL)降解率为94.2%。