论文摘要
目的Soat1基因编码的乙酰辅酶A：胆固醇乙酰转移酶在维持细胞内胆固醇的动态平衡方面具有重要作用,直接或间接地影响了APP的分泌过程及Aβ的产生；Ptgs2基因编码的COX能将花生四烯酸代谢成各种前列腺素类,其中前列腺素E参与了胆固醇的合成和运输,Ptgs2过度表达可增强Aβ的作用强度,加强兴奋毒性引起的神经退行性病变。由此可推测,Ptgs2基因与Soat1基因可能在细胞内胆固醇的运输和转化上存在一定的联系,进而共同参与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的发病。为研究Soat1基因和Ptsg2基因在AD发病过程中协同作用的分子机制,本实验应用基因芯片技术、基因表达数量性状基因座定位(expression Qutative Trati Loci, eQTL)的方法和遗传相关度分析,借助BXD重组近交系(Recombinant Inbred, RI)小鼠,构建Soat1和Ptgs2基因的表达调控网络,从全基因组水平上研究这两个基因参与AD发病的分子机制。方法本实验采用BXDRI小鼠,运用eQTL定位的方法对Soat1基因(Probe set1417697_at)及Ptgs2基因(Probe set1417263_at)的表达变异及表达调控进行研究,研究两基因在BXDRI小鼠及亲本(C57BL/6J和DBA/2)海马组织中的表达差异及差异的变化趋势。采用区间作图在全基因组水平分别定位控制两基因表达变化的基因座(e-QTL)。通过检索数据库获取B6和D2两品系间的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)资料,并分析SNP对eQTL定位的影响。利用ClusterMap在线分析工具检索BXDRI小鼠海马组织基因组中分别受Soat1和Ptgs2基因反式调节的基因,即寻找其下游候选基因。通过皮尔森相关系数法筛选出具有高度遗传相关性的基因,并构建基因表达遗传调控网络。结果RT-PCR结果显示Soat1基因的表达水平在B6和D2两亲本的海马组织中存在显著差异,在B6中的表达量明显高于D2,在BXDRI小鼠海马组织中的平均表达量为7.959(>7),表达量在各品系小鼠中呈线性变化趋势,该结果显示Soat1基因具备QTL定位的条件。通过全基因组区间作图法定位Soat1基因的上游调控位点,发现其自身所在的基因组位置上存在一个连锁值较高的eQTL, LRS值高达89.2,且相对应的探针靶序列上的SNP对eQTL检测无影响,初步判断该基因为顺式调控基因候选基因。运用cluster map在线分析工具检索BXD重组近交系小鼠海马组织基因组中受Soat1反式调节的基因,Soat1基因被定位到反式eQTL富集区,21个基因的反式eQTL被定位到此处,排除连锁不平衡对下游基因定位的影响,结果显示其中的7个基因与Soat1呈显著性偏相关,由此推测这7个基因为Soat1基因的下游候选调控基因。通过皮尔森相关系数法分析Soat1基因与BXD RI小鼠海马组织中其他基因的遗传相关度,获得遗传相关度较高的(>0.43)前18个基因,Ptgs2包含在其中,遗传相关度高达0.61。Ptgs2基因在BXD重组近交系小鼠海马组织中平均表达量高达8.32,在亲本B6小鼠海马组织中表达为8.54,D2中表达量较低为7.86,两亲本间表达差异达1.6倍,差异具有统计学意义,且在BXD重组近交系各个品系间的表达变化呈线性趋势,符合数量性状的特征。基因表达数量性状基因座定位分析发现控制该基因的eQTL为顺式eQTL,即调控该基因表达变化的为该基因自身。该区域同时还是反式eQTL的富集区,偏相关系数分析发现其中有8个基因为Ptgs2基因的下游调控候选基因。皮尔森相关系数分析发现BXD重组近交系小鼠基因组中有151个基因与Ptgs2高度相关,其中前13个基因与Ptgs2的遗传相关度到达0.59以上,Soat1基因包含在其中。在构建的Ptgs2与Soat1基因遗传网络中,有10个基因同时与Soat1基因和Ptgs2基因呈现高度相关性。其中,Dnm3、 Glul两个基因均参与了AD的发病,Dnm3做为Dnm家族成员之一,还参与了胆固醇的运输与代谢。由此推测,Soat1基因可能通过Dnm及Glul基因与Ptgs2基因联系起来共同参与了AD的发病,进一步说明Soat1基因和Ptgs2协同参与了AD的发病。结论本实验可初步判断Soat1、Ptgs2基因为顺式调控基因,Rab2,Taz等7个基因为Soat1基因的下游候选调控基因,Vcam1、Mlstd1等8个基因为Ptgs2基因的下游候选调控基因。无论在Soat1基因遗传相关基因网络中还是在Ptgs2基因遗传相关基因网络中,Ptgs2与Soat1基因都呈现高度相关性。在构建的Ptgs2与Soat1基因网络中,Dnm和Glu1基因同时与Soat1和Ptgs2呈现高度的相关性,并参与了APP的加工和Aβ的产生,由此推测,Soat1基因可能通过Dnm及Glu1基因与Ptgs2基因联系起来共同参与了AD的发病,由此进一步证明Ptgs2与Soat1基因协同参与了AD的发病过程。