论文摘要
研究目的：高原地区属于我国战略要地，其低压、低氧、寒冷等环境因素对人体多个系统产生影响，其中中枢神经系统是对缺氧敏感的重要系统。低氧环境能够对神经系统造成影响已经得到证实，高原低氧对神经系统、认知功能的影响机制作为热点问题受到广泛关注。神经系统的多种病变都与神经细胞中的tau蛋白有关，它是一种微管结合蛋白，当其发生过度磷酸化时会影响微管正常生理功能，可能导致认知功能减退。低氧暴露将对认知功能造成怎样的损伤？具体机制是什么？损伤后能否通过有效手段进行改善，例如营养补充。这一系列问题若能得到解决，将会对高原环境所致认知功能障碍的预防与治疗有重要意义，并可为特殊环境作业人员提供健康指导。研究方法：本研究以昆明小鼠为研究对象，建立慢性低氧暴露模型。通过旷场实验、避暗实验和八臂迷宫从整体水平来评价低氧暴露对学习记忆的影响。应用蛋白免疫印迹从分子水平检测其脑中tau蛋白磷酸化的水平，检测乙酰胆碱相关酶类的活性，观察胆碱能水平的变化。应用HE染色观察神经元的形态变化，判断低氧暴露对神经系统的损伤程度。在明确慢性低氧暴露对小鼠认知功能造成损伤后进一步用胆碱及其它复合B族维生素进行营养干预。从整体水平和分子水平两个层面评价干预效果。因此，研究主要分为两部分：1、不同低氧暴露时间对小鼠认知功能的影响2、补充胆碱及其它复合B族维生素对低氧暴露小鼠认知功能的改善。结果：一、低氧暴露对小鼠学习记忆能力及tau蛋白磷酸化的影响将实验动物随机分为4组：对照组（control group，control）、8h低氧暴露组（8h）、7d低氧暴露组（7d）、28d低氧暴露组（28d）。将模型组动物放入低压舱内，环境条件为模拟海拔5500m高度。对照组放于常氧环境中，温湿度与低氧组基本一致。旷场实验结果显示8h低氧暴露后小鼠穿格数和直立次数呈降低趋势，7d后略有升高，但均不具有统计学意义。28d低氧暴露后在中央区域的停留时间显著延长（P0.05），穿格数和直立次数显著降低。避暗实验结果显示，急性低氧8h后，小鼠避暗潜伏期有下降趋势，连续低氧28d后显著降低(P0.05)，错误次数随着低氧时间的增加而增多。说明急性低氧对小鼠的短期学习记忆能力有损伤，慢性低氧较急性低氧严重。蛋白免疫印迹的实验结果显示在海马组织中，随着低氧时间的增加tau蛋白Thr181、Ser202/T205和Ser396位点的磷酸化程度有上升趋势，在28d低氧暴露后显著升高；低氧暴露8h、7d时，Ser262磷酸化程度未发生明显改变，而28d后其磷酸化程度明显升高。皮层中的磷酸化Thr181、Ser262和Ser396含量在低氧暴露7d后达到最高，28d后略有下降；Ser202/T205位点的磷酸化水平随着时间增加而升高，在28d时达到了最高。GSK-3β是重要的tau蛋白磷酸激酶之一，正常状态下的GSK-3β诱导tau蛋白磷酸化，而过度磷酸化的GSK-3β则会丧失功能，被称为抑制型GSK-3β。Western blot检测结果显示低氧28天后抑制型GSK-3β表达下调，说明低氧暴露导致的tau蛋白过度磷酸化与抑制型GSK-3β减少有关。神经递质乙酰胆碱相关酶类变化的检测结果显示，与常氧环境对照组比较，低氧暴露28天时乙酰胆碱酯酶活性有升高趋势，胆碱乙酰转移酶活性显著降低。由此可知低氧暴露28天对小鼠的学习记忆能力影响最为严重。HE结果显示正常对照组海马CA1区细胞呈椭圆形，染色均一，胞浆清晰，核仁明显，细胞排列紧密有序、层次分明。与正常对照组相比，低氧暴露组海马CA1区细胞排列相对疏松，层次比较清晰。过度的磷酸化可使tau蛋白失去生物学功能，减弱tan蛋白促进和稳定微管聚合的能力，易于聚集成双股螺旋细丝结构，并可与神经元中正常的微管相关蛋白结合，使微管结构崩解，成为毒性分子，进而导致神经元退变。二、补充胆碱及其它复合维生素B对低氧暴露小鼠认知功能的影响将实验动物分成5组：对照组（CONTROL）、低氧暴露模型组（HYPOXIA）、低氧暴露同时补充其它复合维生素B组（HB）、低氧暴露同时补充胆碱组（HC）、低氧暴露同时补充胆碱及其它复合维生素B组（HBC）。干预结束后首先从整体水平检测其行为能力和记忆能力，通过行为学实验检测。旷场实验结果显示，与模型组相比，联合补充胆碱及复合维生素B族组的潜伏期及穿格次数均有明显升高趋势，说明联合补充胆碱和复合维生素B能减轻低氧对其活动能力的影响，可以提高神经系统兴奋性。避暗实验结果显示与模型组相比，单纯补充维生素B族后小鼠的短期记忆能力没有显著性变化，单纯补充胆碱后错误率有下降趋势，联合补充VB和胆碱后潜伏时间显著升高，错误次数下降。说明联合补充胆碱及其它复合维生素B能够改善慢性低氧暴露引起的短期记忆损伤。八臂迷宫实验结果表明，与模型组相比，单纯补充维生素B族后小鼠的典型错误次数和错误时间均未见明显差异，，联合补充胆碱及其它维生素B后典型错误次数和实验时间都有降低趋势(P0.05)。提示补充胆碱对低氧暴露小鼠的空间记忆能力有明显改善。神经递质乙酰胆碱相关酶类变化的检测结果显示，与低氧暴露模型组相比，补充胆碱后乙酰胆碱酯酶活性有下降趋势。由此可知，胆碱干预能够改善中枢胆碱能系统。Western blot检测结果显示，与低氧暴露模型组相比，在海马组织中，单纯补充胆碱后T181位点的磷酸化水平显著升高，联合补充维生素B和胆碱后T181、S262、AT8位点的Tau蛋白磷酸化水平有所升高；在皮层组织中，补充胆碱后T181、S262、AT180、AT8和S396的磷酸化水平均有下降趋势。说明补充胆碱及B组维生素能够从分子水平降低Tau蛋白的磷酸化程度。在皮层和海马中抑制型GSK-3β的含量在联合补充胆碱及维生素B后显著增加。结论慢性低氧暴露28天对小鼠的学习记忆造成损伤，主要机制是低氧因素导致磷酸化tau蛋白含量增加，胆碱能水平乙酰胆碱合成减少，进而影响神经系统功能。通过联合补充胆碱及复合B族维生素能够减轻这种损伤作用，Tau蛋白磷酸化水平下降，学习记忆得到改善。其可能机制是胆碱作为神经递质乙酰胆碱的前体，口服后能够通过血脑屏障，经过与乙酰辅酶A的合成催化使脑内乙酰胆碱含量增加，激活神经元表面受体，启动下游磷酸化酶信号转导，降低tau蛋白的磷酸化水平。