论文摘要
目的研究PI3K抑制剂3-MA、DNA-PKcs及分割照射对细胞自噬的影响；构建用于有效NBA1敲除的质粒对；建立NBA1稳定敲低及过表达的细胞系,初步探讨其对细胞辐射敏感性、周期进程及电离辐射诱导的G2/M期阻滞的影响,为今后进一步研究NBA1与自噬的关系打下实验基础。方法采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖毒性,AnnexinV-FITC/PI双标记检测细胞凋亡,免疫荧光观察细胞自噬体形成,western blotting检测自噬相关蛋白表达；采用类转录激活因子效应物核酸酶技术构建用于有效NBA1敲除的质粒对,SSA法鉴定其体外活性,酶切法进一步鉴定切割效果；采用包病毒感染法和Lipofectamin2000旨质体转染法构建NBA1稳定敲低和过表达的MCF-7细胞系,quantitative Real-Time PCR和western blotting分别鉴定敲低及过表达效果,克隆形成率实验鉴定细胞系辐射敏感性,胸腺嘧啶双阻滞释放法结合流式细胞仪分析细胞周期的变化。结果1.5mM3-MA持续作用24h可引起细胞增殖毒性,辐射和3-MA单独作用都能诱发细胞自噬；同一时间点,DNA-PKcs敲低p62表达降低,单剂量(4Gy)照射p62表达降于分割(2Gy×2)照射。2.成功构建能特异性识别并结合NBA1目标序列的TALEN质粒三对(T12、T34和T56),SSA法鉴定显示T56具有更高的切割效率,进一步酶切鉴定显示T56可以用于NBAl基因的敲除。3. Western blotting和qRT-PCR结果显示NBA1稳定敲低和过表达的MCF-7细胞系构建成功；克隆形成率实验显示NBA1敲低细胞克隆形成率低于对照细胞；TdR双阻断显示NBA1敲低细胞G2/M期延长,辐射诱导的G2/M期阻滞减弱。结论1.P13K抑制剂3-MA能以浓度和时间依赖的方式影响细胞增殖,能以抑制和促进自噬两种方式影响细胞存活,DNA-PKcs敲低增强辐射诱导的细胞自噬活性,分割照射减弱辐射诱导的细胞自噬活性。2.利用单元拼接,酶切连接“单元重组”法能够更有效的构建出用于NBA1基因敲除的TALEN打靶序列。3.NBA1敲低细胞辐射敏感性增加,细胞周期进程减慢,辐射诱导的G2/M期阻滞减弱。