论文摘要
近年来，由于人为污染、气候变化等因素影响，世界各地海域出现大规模水母暴发现象，对海洋渔业等领域造成重大经济损失。事实上，水母也是对人类伤害最大的海洋动物之一，水母蜇伤是世界上最常见的海洋生物伤。据报道，有毒水母蜇伤能引起局部或全身中毒症状，严重者甚至会发生死亡，因此，目前危及生命的水母蜇伤问题越来越得到重视。研究发现，致命性的水母蜇伤综合征与毒素的吸收剂量密切相关：①大剂量毒素吸收可导致急性心血管衰竭和不同程度的心脏阻滞，患者可在数小时内快速死亡；②中等剂量毒素吸收可影响中枢神经系统，从而抑制呼吸，使患者因呼吸衰竭而死，死亡可发生在蜇伤后数分钟至数小时内；③相对低剂量毒素吸收可能会引起延迟性多器官损伤，肝、肾损伤尤其显著，患者可在蜇伤数天至数周内死亡，发病机制尚不清楚。由此可见，区分不同类型的致命性水母蜇伤综合征，并正确认识其不同的致病机理是研究水母蜇伤中毒急救和预防药物的前提和基础。本文第一部分采用发形霞水母（Cyanea capillata，C. capillata）触手提取物（tentacle extract，TE）作为毒素样品，在小鼠和大鼠模型上，通过心电图、血流动力学监测、病理学检查、血生化分析等检测方法，结合中毒动物的症状和生存时间记录，系统分析TE的剂量、时间-效应关系，从而建立急性/延迟性水母蜇伤综合征（acute/delayed jellyfish envenomation syndrome，AJES/DJES）动物模型，以模拟临床上患者被有毒水母蜇伤后的中毒表现。综合各项检测结果，我们推测：TE诱导的急性死亡主要源于心血管衰竭；而延迟性死亡主要源于出血导致的肝肾衰竭。为了进一步明确AJES的致病机理，本文的第二部分研究在心血管系统展开：首先，在离体脏器（离体心脏、离体血管）水平，我们发现TE具有直接心脏毒性效应和血管收缩效应；其次，在细胞水平，我们发现TE能引起心血管效应细胞（心肌细胞、血管平滑肌、内皮细胞）胞浆[Ca2+]i升高，提示Ca2+信号异常可能是TE所致心脏毒性、血管收缩及NO释放的主要原因；而膜促融剂PEG4000/6000不仅能抑制这三组细胞的胞浆[Ca2+]i升高，而且还能明显改善TE引起的离体心脏损伤，因此我们猜测：TE中可能含有穿孔素，能在细胞膜上形成非特异性孔道引起细胞Ca2+超载，最终导致AJES动物因急性循环衰竭而死，而PEG通过修复细胞膜，可有效抑制TE诱导的Ca2+超载，从而保护心血管系统。除此之外，我们还发现血管内皮细胞在TE诱导的缩血管反应中起一定保护作用，其作用主要是通过升高胞浆[Ca2+]i，激活PI3K/Akt/eNOS信号通路，产生NO发挥的，外源性给予NO（SNP）后能有效模拟内皮的保护作用。另一方面，为了进一步明确DJES的致病机理，本文的第三部分研究围绕肝肾出血性损伤的作用机制展开：首先，通过酶解法我们证实了TE样品具有金属蛋白酶活性；其次，采用SR-μA和SR-μCT技术，我们直接清晰地观察到实验动物（小鼠/大鼠）的微血管结构，并且证实了TE可诱发DJES动物模型的肝肾微小血管损伤，而金属蛋白酶抑制剂巴马司他（Batimastat，BB-94）可显著改善TE诱导的肝肾微血管损伤；最后，通过组织病理学观察我们证实了TE可诱导严重的肝肾组织出血效应，而BB-94可明显改善TE诱导的出血性损伤，上述结果提示：TE中含有金属蛋白酶，具有降解细胞外基质的作用，它是TE诱导的血管损伤、肝肾衰竭的主要原因，也是DJES的主要致病因子，而BB-94能有效抑制其血管损伤效应，因此，在DJES治疗方面具有良好的应用前景。成功治愈水母蜇伤相关疾病，尤其是致命性水母蜇伤综合征是研究水母毒素生物活性的主要目标，因此，本文第四部分选择前期筛选有效的拮抗药物：①IP3R抑制剂（Heparin），②NO供体（SNP），③膜促融剂（PEG4000/6000），④金属蛋白酶抑制剂（BB-94）；同时结合文献报道的治疗药物：①L-型钙通道阻断剂（Verapamil，Diltiazem，Nifedipine），②肾上腺素受体阻断剂（Phentolamin，Prazosin，Propranolol，Atenolol），③MgSO4，④Zinc Gluconate，在AJES/DJES动物模型上进行干预治疗。通过生存率分析和血流动力学监测，我们发现：血管相关药物（包括MgSO4、Heparin、SNP）以及膜促融剂（PEG4000/6000）都能明显降低AJES小鼠模型的急性死亡率，说明血管收缩及膜穿孔在TE诱导的急性心功能损伤方面有重要作用；此外，PEG4000/6000+BB-94联合用药既能明显降低中毒小鼠的急性死亡率，又能降低其延迟性死亡率，说明在严重水母蜇伤的病例中，应给予PEG+BB-94联合治疗，以对抗膜穿孔和酶损伤两大致病因子。另一方面，在DJES大鼠模型上，通过血生化检测和病理学检查等手段，我们验证了BB-94对TE诱导的多脏器损伤，尤其是肝、肾损伤具有良好的保护作用，考虑到BB-94的有效性和安全性，我们推荐在临床上将BB-94用于DJES的治疗。总而言之，本课题成功建立了AJES/DJES模型，初步探讨了AJES的致病机理，主要是TE中含有穿孔素，在细胞膜上形成非特异性孔道，导致细胞钙超载，引起冠脉痉挛，心脏受损，最终导致急性循环衰竭，而血管相关药物（包括MgSO4、Heparin、SNP）以及膜促融剂（PEG4000/6000）在AJES治疗方面具有良好的应用前景。此外，DJES的主要致病机理是TE含有金属蛋白酶成分，可通过降解细胞外基质诱发出血效应，从而导致肝肾组织损伤，而金属蛋白酶抑制剂（BB-94）能有效抑制金属蛋白酶诱导的血管损伤效应，因此，我们推荐BB-94用于DJES的临床治疗。最后，考虑到膜穿孔和酶损伤两大致病因子，我们建议联合采用PEG4000+BB-94用于治疗严重的水母蜇伤综合征病例。