论文摘要
目的：运用分子生物学等实验技术与方法，通过研究苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导的血管内皮细胞(EA.hy926细胞）IRS2/eNOS信号途径的影响，从基因水平上探讨苦荞麦总黄酮改善胰岛素抵抗的分子机制，为苦荞麦总黄酮作为治疗胰岛素抵抗的临床用药提供相关实验依据。材料与方法：体外培养人脐静脉血管内皮细胞（EA.hy926）,采用高浓度的软脂酸（Palmitic Acid，PA）建立胰岛素抵抗状态血管内皮细胞模型。实验分为正常组、模型组、苦荞麦总黄酮组和二甲双胍组。4组均加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养基和终浓度为50nmol/L的胰岛素；除正常对照组外其他各组加入终浓度为600μmol/L的软脂酸；苦荞麦总黄酮组分为低、中、高三个浓度，各组分别加入终浓度为31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml的苦荞麦总黄酮；二甲双胍组加入终浓度为2mmol/L的二甲双胍。利用MTT比色法检测各组细胞增殖率；通过硝酸还原酶法测定各组细胞上清液NO含量；RT-PCR测定各组细胞IRS2、PI3K、Akt、eNOS mRNA的表达；免疫组化及westernblot法测定各组细胞IRS2、PI3K、Akt、eNOS蛋白的表达。检测苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导的血管内皮细胞IRS2/eNOS信号途径的影响，进而探讨苦荞麦总黄酮治疗胰岛素抵抗的分子机制，为2型糖尿病的治疗和苦荞麦总黄酮的临床应用提供实验依据。结果：1苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导下EA.hy926细胞增殖率的影响各组细胞MTT结果表明，与正常组相比，模型组细胞增殖率显著降低（P<0.05），抑制率可达50%以上，有统计学意义；苦荞麦总黄酮低、中、高剂量组及二甲双胍组与模型组相比，细胞增殖率明显升高（P<0.05）；苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组相比无显著性差异（P>0.05）。2苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导下EA.hy926细胞上清液NO含量的影响各组细胞上清液NO含量检测结果表明，与正常组相比，模型组细胞上清液NO含量明显减少（P<0.05）；苦荞麦总黄酮低剂量组与模型组相比，差异不显著（P>0.05）；但苦荞麦总黄酮中、高剂量组和二甲双胍组与模型组相比，细胞上清液NO含量明显升高（P<0.05）；苦荞麦总黄酮中剂量组与二甲双胍组差异不显著（P>0.05）；苦荞麦总黄酮高剂量组细胞上清液中NO的含量明显高于二甲双胍组（P<0.05）。3苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导下EA.hy926细胞IRS2表达的影响RT-PCR结果表明，与正常组相比，模型组细胞IRS2mRNA表达明显减少（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组、二甲双胍组和模型组细胞相比IRS2mRNA表达显著提高（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组与二甲双胍组细胞相比，IRS2mRNA表达无显著差异（P>0.05）。免疫组化结果显示，与正常组相比，模型组细胞阳性细胞较少，并且细胞形态也发生变化，细胞呈现不规则形状，统计结果显示IRS2蛋白表达显著减少（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组、二甲双胍组和模型组细胞相比，镜下出现较多阳性细胞，并且细胞形态与正常组细胞形态相近，统计结果表明IRS2蛋白表达明显提高（P<0.05）；苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组相比，统计结果显示无显著性差异。western blot结果显示，与正常组相比，模型组细胞IRS2蛋白表达显著减少（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组、二甲双胍组和模型组细胞相比IRS2蛋白表达明显提高（P<0.05）；治疗组间相比无显著性差异。4苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导下EA.hy926细胞PI3K表达的影响RT-PCR结果表明，与正常组相比，模型组细胞PI3K mRNA表达明显减少（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组、二甲双胍组和模型组细胞相比PI3K mRNA表达显著提高（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组与二甲双胍组细胞相比PI3K mRNA表达无显著差异（P>0.05）。免疫组化结果显示，与正常组相比，模型组细胞阳性细胞较少，并且细胞形态也发生变化，细胞呈现不规则形状，统计结果显示PI3K蛋白表达显著减少（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组、二甲双胍组和模型组细胞相比，镜下出现较多阳性细胞，并且细胞形态与正常组细胞形态相近，统计结果表明PI3K蛋白表达明显提高（P<0.05）；苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组相比，统计结果显示无显著性差异。5苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导下EA.hy926细胞Akt表达的影响RT-PCR结果表明，与正常组相比，模型组细胞Akt mRNA表达明显减少（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组、二甲双胍组和模型组细胞相比Akt mRNA表达显著提高（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组与二甲双胍组细胞相比Akt mRNA表达无显著差异（P>0.05）。免疫组化结果显示，与正常组相比，模型组细胞阳性细胞较少，并且细胞形态也发生变化，细胞呈现不规则形状，统计结果显示Akt蛋白表达显著减少（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组、二甲双胍组和模型组细胞相比，镜下出现较多阳性细胞，并且细胞形态与正常组细胞形态相近，统计结果表明Akt蛋白表达明显提高（P<0.05）；苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组相比，统计结果显示无显著性差异。6苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导下EA.hy926细胞eNOS表达的影响RT-PCR结果表明，与正常组相比，模型组细胞eNOS mRNA表达明显减少（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组、二甲双胍组和模型组细胞相比eNOS mRNA表达显著提高（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组与二甲双胍组细胞相比eNOS mRNA表达无显著差异（P>0.05）。免疫组化结果显示，与正常组相比，模型组细胞阳性细胞较少，并且细胞形态也发生变化，细胞呈现不规则形状，统计结果显示eNOS蛋白表达显著减少（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组、二甲双胍组和模型组细胞相比，镜下出现较多阳性细胞，并且细胞形态与正常组细胞形态相近，统计结果表明eNOS蛋白表达明显提高（P<0.05）；苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组相比，统计结果显示无显著性差异。western blot结果显示，与正常组相比，模型组细胞eNOS蛋白表达显著减少（P<0.05）；苦荞麦总黄酮高浓度组、二甲双胍组和模型组细胞相比eNOS蛋白表达明显提高（P<0.05）；治疗组间相比无显著性差异。结论：1高浓度软脂酸能有效降低血管内皮细胞增殖率，降低细胞上清液NO的释放量，苦荞麦总黄酮与二甲双胍干预治疗后，可以显著提高细胞的增殖率，增加细胞NO的释放量；2模型组细胞IRS2、PI3K、Akt、eNOS mRNA及蛋白表达水平均明显降低，苦荞麦总黄酮干预治疗后IRS2、PI3K、Akt、eNOS mRNA及蛋白表达水平均显著提高，其作用与二甲双胍相当；3模型组血管内皮细胞内IRS2/eNOS信号通路被明显抑制，苦荞麦总黄酮干预治疗后，该信号途径被激活，从而达到改善胰岛素抵抗的目的。