论文摘要
目的：中药多糖是中药发挥免疫调节作用的重要活性成分,但是由于多糖空间结构复杂,活性中心多样,分子量庞大等原因使其吸收率极低,给相关的免疫调节机制研究带来很大的困难。本论文避开多糖吸收的问题,选用香菇多糖为代表药物,以肠道粘膜免疫系统为主要观察对象,并针对肠道派氏结中淋巴细胞活化及其诱导M样细胞分化的机制,试图从肠道粘膜免疫局部的免疫应答探讨多糖的免疫调节作用机制,并期望在此研究基础上,为不易吸收的药物尤其是中药汤药的免疫药理作用的相关研究奠定基础。方法：1、香菇多糖含量测定：硫酸-苯酚法检测样品中香菇多糖的含量2、免疫抑制模型的建立：选用环磷酰胺和地塞米松两种免疫抑制剂,以DTH小鼠的肠道派氏结和耳后淋巴结中淋巴细胞比例活化为主要观察指标,并结合脏器指数和小鼠DTH反应能力,观察不同剂量的免疫抑制剂的作用效果,选择合适的免疫抑制模型建立方法。3、香菇多糖对系统免疫和肠道粘膜免疫功能的影响,确定香菇多糖的免疫调节作用：通过脏器指数,脾脏淋巴细胞的增殖转化和迟发型超敏反应情况观察不同剂量的香菇多糖对免疫抑制小鼠系统免疫功能的影响；选出药效最佳剂量的香菇多糖,通过肠道派氏结数目,肠道sIgA分泌水平,派氏结内淋巴细胞比例、T细胞亚群和活化等情况观察香菇多糖在调节系统免疫情况下对肠道粘膜免疫功能的影响。4、通过不同给药方式研究香菇多糖对系统和肠粘膜局部免疫功能的影响,揭示肠道粘膜免疫系统在口服药物发挥免疫调节作用中的重要性：选用口服和腹腔注射两种方式给予香菇多糖,以脾脏淋巴细胞、肠系膜淋巴结细胞、肠道派氏结淋巴细胞的增殖转化能力,小鼠DTH反应,肠道sIgA分泌水平,以及DTH模型小鼠肠道派氏结和耳后淋巴结中淋巴细胞比例活化的影响,观察不同给药途径下,香菇多糖对系统免疫和肠道粘膜免疫功能的影响。5、观察香菇多糖对肠道M细胞数目的影响,推测香菇多糖调节肠道粘膜免疫系统的可能机制：组织切片观察香菇多糖对免疫抑制小鼠肠道派氏结淋巴组织的损伤修复,免疫组化的方法观察香菇多糖对免疫抑制小鼠肠道派氏结M细胞数量的影响；用派氏结淋巴细胞与Caco-2细胞共培养,诱导Caco-2细胞向M样细胞转化,并以转化后细胞转运荧光微球功能的获得及细胞表面结构的变化鉴定转化结果；借此诱导转化体系,观察灌胃香菇多糖后,免疫抑制小鼠派氏结淋巴细胞对Caco-2细胞向M样细胞转化的影响。6、观察香菇多糖对脾脏、肠系膜淋巴结和派氏结和派氏结淋巴细胞体外活性的影响,推测香菇多糖对派氏结淋巴细胞活化及其诱导M细胞分化的可能机制：用不同浓度的香菇多糖协同ConA作用派氏结淋巴细胞,MTT方法检测各孔活细胞数,比较刺激指数的变化。不同浓度的香菇多糖脾脏、肠系膜淋巴结和派氏结淋巴细胞体外混合培养,MTT方法检测各孔活细胞数量并比较其不同。结果：1、硫酸-苯酚法检测样品中多糖含量约为62-63%。2、各浓度的环磷酰胺和地塞米松都有一定的免疫抑制作用,其中100mg/kg和120mg/kg剂量的环磷酰胺对小鼠脏器指数、派氏结数目、DTH反应及DTH反应下小鼠耳后淋巴结和肠道派氏结中淋巴细胞比例和活化均有显著抑制作用,与对照组比较均具有统计学意义。地塞米松对小鼠脏器指数和肠道派氏结数目具有显著抑制作用,但对小鼠DTH反应及DTH反应条件下T细胞活化的抑制作用不明显。3、香菇多糖对免疫抑制小鼠脏器指数,脾脏淋巴细胞的增殖转化和迟发型超敏反应均有一定的改善作用,其中600mg/kg和800mg/kg给药剂量下作用更明显,呈剂量相关趋势；800mg/kg香菇多糖对免疫抑制肠道派氏结数目,肠系膜淋巴结和派氏结淋巴细胞的增殖转化能力,肠道sIgA分泌能力,派氏结中淋巴细胞活化均具有明显的改善恢复作用,与免疫抑制模型组比较,差异均具有统计学意义。4、口服或腹腔注射香菇多糖后,免疫抑制小鼠的系统免疫均表现出不同程度恢复趋势。在口服香菇多糖组,小鼠脾脏、肠系膜淋巴结和派氏结淋巴细胞的增殖转化能力,肠道sIgA分泌水平,小鼠DTH反应均有显著改善,与免疫抑制模型相比,差异均具有统计学意义；而注射香菇多糖组,只有派氏结淋巴细胞的增殖转化能力有显著改善,与模型组比较,差异具有统计学意义。在DTH反应条件下,口服香菇多糖后,耳后淋巴结和肠道派氏结中细胞比例和活化均有恢复趋势,其中派氏结中淋巴细胞比例和T细胞活化改善明显,与模型组比较差异具有统计学意义；而注射组的改善程度不明显,在细胞活化部分,只有耳后淋巴结中T细胞的CD69表达增加明显,与模型组比较差异具有统计学意义。5、环磷酰胺免疫抑制后,派氏结淋巴细胞松散,滤泡相关上皮中的M细胞的数量明显减少,与对照组比较,差异具有统计学意义；给予香菇多糖后,派氏结中淋巴细胞丰富,滤泡相关上皮中的M细胞数量增多,与模型组比较,差异具有统计学意义；在M细胞的诱导体系中,经过派氏结淋巴细胞的诱导转化,Caco-2细胞表面的微绒毛减少甚至消失,并获得跨细胞转运荧光微球的能力；经过香菇多糖灌胃后,小鼠的派氏结淋巴细胞在ConA的协同作用下可以明显增加诱导体系中Caco-2细胞的微球转运率,与免疫抑制组比较,差异具有统计学意义,而细胞表面微绒毛减少情况也比模型组明显。6、香菇多糖在协同ConA作用时,可以明显促进派氏结淋巴细胞的体外增殖,其中50～400μg/ml间的四个浓度的刺激指数与单纯ConA刺激对照孔比较,差异具有统计学意义,并在50～200μg/ml浓度之间呈现正相关的关系。在无ConA协同作用下,香菇多糖同样可以维持脾脏、肠系膜淋巴结和派氏结的淋巴细胞的体外活性,且对派氏结淋巴细胞作用明显,甚至表现出一定的促增殖转化的作用,其中6.25、12.5、25μg/ml和200、400μg/ml的OD值与细胞对照孔比较,差异均具有统计学意义。结论：1、此含量的粗多糖基本满足本实验的需求。2、100mg/kg剂量的环磷酰胺更适合用于本实验中免疫抑制模型的制造。3、香菇多糖在增强免疫抑制小鼠系统免疫功能的同时,对肠道粘膜免疫系统同样具有免疫调节作用,结合多糖不易吸收的特点,提示肠道粘膜免疫系统可能在多糖调节免疫作用中发挥重要的作用。4、口服给药组无论是对肠道粘膜免疫或是系统免疫,均有明显的免疫调节作用,腹腔注射组对系统免疫的免疫抑制状态有一定的改善作用,但对肠道粘膜免疫作用微弱,提示肠道粘膜免疫系统在多糖发挥免疫调节作用中的靶点地位。5、香菇多糖改善派氏结形态以及增加派氏结滤泡相关上皮中的M细胞数量的作用,提示调节肠道粘膜免疫系统的作用可能与其维持淋巴细胞数量以稳定派氏结形态和维持其中淋巴细胞活化水平密切相关,而M细胞很可能是该作用中的关键细胞。6、香菇多糖对派氏结淋巴细胞的活性维持或促增殖活化的作用,提示香菇多糖对派氏结淋巴细胞有直接的免疫活性作用,不易吸收的香菇多糖发挥免疫调节作用很可能时借助诱导粘膜局部免疫应答。