论文摘要
癌痛即恶性肿瘤引起的疼痛。因其程度剧烈,难以忍受,严重影响了患者正常工作和生活。其中由原发性骨肉瘤、乳腺癌、前列腺癌或肺癌等肿瘤转移至骨所致的疼痛最为常见。目前临床用于镇痛的药物因成瘾性或其他毒副作用严重限制了其使用,因此研究并阐明骨癌痛的病理机制以寻求安全有效缓解疼痛的临床治疗药物,提高患者生存质量势在必行。骨癌痛具有独特复杂的病理机制,至今未能完全阐明。近年来,结合国内外及我们实验室前期工作表明,骨癌痛的发生不同于单纯的炎症痛或神经痛。在胫骨癌痛大鼠模型上,表现为大鼠脊髓背角胶质细胞显著激活增生,脊髓中各种炎性细胞因子如白介素-1beta (Interleukin-1β, IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子-alfa (Tumor necrosis factor Alfa, TNF-α)表达上调,被称之为神经炎症(Neuroinflammation),与骨癌痛的发生密切相关。此外在对炎症痛、神经痛和骨癌痛三种病理性疼痛的相关机制研究中发现,在骨癌痛模型上脊髓强啡肽(Dynorphin, DYN)阳性神经元表达显著增加,抑制其表达可缓解骨癌痛,提示强啡肽与骨癌痛的发生密切相关。生理状态下,体内存在一整套精密的炎症调控系统,通过动态调节体内抗炎和致炎两种力量,维持内稳态平衡。在急性炎症期,机体通过产生各种抗炎脂类介质如脂氧素(Lipoxins, LXs)、Resolvins、Protectins等抑制炎性因子产生,促进炎症消退。当机体内源性产生的抗炎介质不足以抵制入侵致炎因子,即转变为慢性炎症,迁延不愈,导致疾病的发生。脂氧素作为机体可内源性产生的一类抗炎脂类介质引起广泛关注。脂氧素是一类来源于花生四烯酸(Arachidonic acid, AA)经一系列脂氧合酶(Lipoxygenases, LOs)代谢产生的具有抗炎和促炎症消退的脂类介质,被誉为炎症过程的“刹车信号”。根据其生成途径及参与调节的酶不同,主要包括脂氧素A4(Lipoxin A4, LXA4)、脂氧素B4(Lipoxin B4, LXB4)、阿司匹林诱生型脂氧素A4(Aspirin Triggered Lipoxin A4,ATL)和15-epi-LXB4。脂氧素合成后主要通过与脂氧素受体(Lipoxin A4receptor, ALX)结合,发挥抗炎和促炎症消退的作用。研究表明：预先给予LXA4可显著抑制脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导的小鼠巨噬细胞株RAW264.7相关炎性因子的释放和大鼠肺泡毛细血管内皮细胞炎症；在足底注射角叉菜胶引起的大鼠炎症痛模型中,系统及鞘内给予脂氧素及其类似物可显著缓解疼痛,并抑制相关信号通路激活；在慢性压迫性背根神经节损伤(Chronic Compression of DRG, CCD)造成的大鼠神经痛模型上,鞘内给予LXA4可缓解神经痛并抑制炎性因子产生。综上所述,脂氧素及其类似物在炎症痛及神经痛模型上均能发挥抗炎镇痛的作用,但是关于其在骨癌痛中的作用尚未见相关报道。因此探究脂氧素及其类似物是否能够参与缓解骨癌痛及其相关分子机制是本课题的研究内容之一。脂氧素主要通过三种途径合成：1)通过细胞间的相互作用,主要是多形核粒细胞(Polymorphonuclear leukocyte, PMN)与血管内皮细胞或气道上皮细胞在15-LO和5-LO的参与下生成；2)通过细胞与血小板间的相互作用,多形核粒细胞和血小板在12-LO、5-LO的参与下合成；3)通过阿司匹林诱导,使环氧酶-2(COX-2)乙酰化,在5-LO的催化下生成。其中脂氧合酶5-LO、12-LO和15-LO与脂氧素的生成密切相关。但是这些脂氧合酶不但参与机体内源性抗炎脂类介质的产生,与机体内源性致炎脂类介质如白细胞三烯、前列腺素的合成也有密切联系。5-LO是白细胞三烯合成所必须的关键酶。足底注射三种脂氧合酶抑制剂可通过抑制c-Fos表达缓解足底注射角叉菜胶引起的大鼠炎症痛,上调12/15-LO活动诱发p-ERK显著激活。以上研究表明,脂氧合酶作为双刃剑,参与了机体内源性抗炎和致炎脂类介质的产生,其异常表达可能会打破两者间平衡导致疾病发生。中医药是一个伟大的宝库,寻找具有抗炎镇痛作用的中药单体化合物并研究其对癌痛的镇痛作用,具有重要理论与实践意义。我们注意到对脂氧合酶具有调节作用的一种来自中药黄芩的抗炎物质：黄芩素(Baicalein, BE)。黄芩素是12/15-LO外源性抑制剂,是提取自中药黄芩的一种黄酮类重要有效成分,分子式C15H10O5,相对分子质量270.24。黄芩,苦、寒,归肺、脾、胃、大肠、小肠经,具有清热燥湿、泻火解毒、止血、降血压等作用。临床常用于湿热痞满、泻痢、黄疸、痈肿疮毒等。药理研究表明,黄芩素具有抗炎镇痛、抗菌、抗病毒、调节免疫等作用,主要与其抑制炎性因子表达、阻断MEK-ERK信号通路、降低NF-κB激活等相关。12/15-LO是参与内源性抗炎和致炎脂类介质合成的关键酶,那么在骨癌痛大鼠模型上,脂氧合酶的表达是否会发生变化?外源性给予黄芩素能否发挥抗炎镇痛作用?对内源性脂氧合酶有何影响?其发挥抗炎镇痛的具体分子机制是什么?这是本课题研究的另一内容。综上所述,本课题拟在大鼠胫骨癌痛模型上,从行为学到形态学等不同方面,采用von-Frey Hair, Real-Time PCR、免疫荧光法和Western Blot技术,开展下列研究：1)观察脂氧素及其类似物在骨癌痛大鼠中的作用及相关机制；2)观察黄芩素对大鼠骨癌痛的影响、脂氧合酶变化及相关分子机制。实验结果如下：1.脂氧素及其类似物提高骨癌痛大鼠机械痛阈1.1骨癌痛大鼠模型建立及评价大鼠随机分成三组：正常组(Naive)、给予PBS的假手术组(Sham)和给予肿瘤细胞的模型组(Cancer)。用von-Frey Hair采用up-and-down方法测定大鼠机械痛阈(Paw Withdrawal Threshold, PWT)。结果显示：从造模后第三天开始,与Naive组相比,Cancer组术侧PWT显著降低,出现痛觉过敏,伴随体重下降。X光片及胫骨病理切片也可看到显著骨质破坏。由于骨癌痛大鼠在后期表现为显著的恶病质,伴随严重的骨质破坏导致拖曳步态,不利于分子生物学指标检测及痛行为的测定。因此选择造模后痛阈稳定且生理状态良好的术后七到十一天作为主要干预时间点。1.2观察鞘内给予脂氧素及其类似物对正常大鼠机械痛阈影响将大鼠随机分为五组：Naive、Naive+NS、Naive+LXA40.1μgNaive+LXB40.1μg和Naive+ATL0.1μg组。测定基础痛阂后鞘内给药,在给药后2、4、6小时测痛。结果显示：与Naive组相比,鞘内给予NS、LXA4、LXB4或ATL对正常大鼠的机械痛阈无显著影响。1.3观察鞘内给予脂氧素及其类似物对骨癌痛大鼠机械痛阈影响造模后,大鼠随机分成四组：Cancer+NS、Cancer+LXA40.1μg、Cancer+LXB40.1μg和Cancer+ATL0.1μg组。造模后第七天,测痛后鞘内给药,在给药后2、4、6小时测痛。结果显示：与Cancer+NS组比较,给予LXA4、LXB4或ATL后均可显著提高骨癌痛大鼠机械痛阈,并以ATL效果最为显著。因此在接下来的实验中,以ATL为主,进一步探究其对骨癌痛大鼠机械痛阂影响及相关机制。小结：鞘内给予脂氧素及其类似物可显著提高骨癌痛大鼠机械痛阈,以ATL作用最为显著,但对正常大鼠机械痛阈无显著影响。2.外源性给予ATL通过ALX提高骨癌痛大鼠机械痛阈2.1ALX在骨癌痛大鼠脊髓中的表达和分布将大鼠随机分成三组：Naive、Sham和Cancer组。造模后第十一天,将三组大鼠分成两部分：一部分灌流取材,采用免疫荧光双标法结合激光共聚焦显微镜扫描观察,检测神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物GFAP、小胶质细胞标记物CD11b和脂氧素受体标记物ALX在大鼠脊髓背角的表达情况；另一部分新鲜取材,采用Western Blot技术检测大鼠脊髓脂氧素受体在蛋白水平的表达变化。免疫荧光法结果表明：与Naive组相比,在Cancer组,星形胶质细胞标记物GFAP和小胶质细胞标记物CDllb在骨癌痛大鼠脊髓背角免疫反应阳性信号光密度显著增强,脂氧素受体标记物ALX主要与星形胶质细胞标记物GFAP共标,少量与神经元标记物NeuN共标,与小胶质细胞标记物CD11b则没有共标；Western Blot检测结果显示：与Naive组相比,在Cancer组脊髓脂氧素受体的蛋白表达水平没有显著改变。2.2ATL通过ALX提高骨癌痛大鼠机械痛阈2.2.1鞘内给予ALX拮抗剂BOC-2对骨癌痛大鼠机械痛阈无显著影响造模后,将大鼠随机分成四组：Cancer+DMSO、Cancer+BOC-210μg、Cancer+BOC-250μg和Cancer+BOC-2100μg组。造模后第十一天,测痛后鞘内给药,在给药后1、2、3、4、6小时测痛。结果显示：与Cancer+DMSO组相比,鞘内给予不同剂量BOC-2对骨癌痛大鼠机械痛阈无显著影响。因此在下一步实验采用100μg的BOC-2观察其对ATL镇痛作用的影响。2.2.2鞘内给予ALX拮抗剂BOC-2可拮抗ATL对骨癌痛大鼠的镇痛作用造模后,将大鼠随机分成四组：Cancer+DMSO、Cancer+BOC-2100μg、 Cancer+ATL0.1μg和Cancer+BOC-2100μg+ATL0.1μg组。造模后第十一天,测痛后鞘内给药,在给药后0.5、1、1.5、2、3、4、6小时测痛。结果显示：与Cancer+DMSO组相比,Cancer+BOC-2100μg组对骨癌痛大鼠机械痛阈没有影响,Cancer+ATL0.1μg组可显著缓解骨癌痛,但Cancer+BOC-2100μg+ATL0.1μg组则与Cancer+DMSO组无差异。提示：BOC-2可拮抗ATL缓解骨癌痛的作用。2.3鞘内给予不同剂量ATL均可提高骨癌痛大鼠机械痛阈造模后,将大鼠随机分为四组：Cancer+NS、Cancer+ATL0.01μg、Cancer+ATL0.1μg和Cancer+ATL0.15μg组。造模后第十一天,测痛后鞘内给药,在给药后2、4、6、8、12小时测痛。结果显示：与Cancer+NS组相比,给予不同剂量ATL均可缓解骨癌痛,并且随着剂量增加,镇痛效应增强,镇痛时程也有所延长。2.4鞘内给予ATL和吗啡对骨癌痛大鼠镇痛作用的比较造模后,将大鼠随机分成四组：Cancer+NS、Cancer+Morphine0.1μg、 Cancer+Morphine5μg和Cancer+ATL0.1μg组。造模后第十一天,测痛后鞘内给药,并在给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6小时测痛。结果显示：与Cancer+NS组相比,鞘内给予5μg吗啡镇痛效果较强；鞘内给予0.1μgATL和吗啡均可缓解骨癌痛,其中吗啡出现镇痛高峰较早,但是ATL作用更为持久。2.5尾静脉给予不同剂量ATL提高骨癌痛大鼠机械痛阈造模后,将大鼠随机分成三组：Cancer+NS、Cancer+ATL10μ/kg和Cancer+ATL40μg/kg组。造模后第十一天,测痛后尾静脉给药,并在给药后1、2、3、4、6、8、12小时测痛。结果显示：与Cancer+NS组相比,系统给予不同剂量ATL均能缓解骨癌痛,并且以40μg/kg的大剂量组镇痛效果更为显著。小结：与对照组相比,在模型组脂氧素受体表达无显著改变；脂氧素受体在脊髓背角主要分布于星形胶质细胞,少量分布于神经元；在模型组大鼠脊髓背角星形胶质细胞标记物GFAP和小胶质细胞标记物CDllb表达显著增加,但是脂氧素受体标记物ALX没有显著改变。鞘内给予脂氧素受体拮抗剂BOC-2可拮抗ATL缓解骨癌痛,提示ATL发挥镇痛作用是通过ALX。鞘内及尾静脉给予不同剂量ATL均能缓解骨癌痛,随剂量增加,镇痛效果随之增强；与鞘内给予相同剂量吗啡相比,ATL镇痛作用更为持久。3.ATL提高骨癌痛大鼠机械痛阈的相关机制研究3.1鞘内给予ATL抑制骨癌痛大鼠脊髓炎性细胞因子表达将大鼠随机分成三组：Naive、Cancer+NS和Cancer+ATL0.1μg组。造模后第十一天,鞘内给药,给药后2小时,动物新鲜取材,选取脊髓L4-L6节段,进行Real-TimePCR实验。观察大鼠脊髓炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达变化。结果显示：与Naive组相比,在Cancer+NS组IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达上调。给予ATL后抑制IL-1β和TNF-αmRNA的表达。3.2鞘内给予ATL抑制骨癌痛大鼠脊髓MAPK信号通路激活大鼠造模后随机分成五组：Naive、Sham、Cancer、Cancer+NS和Cancer+ATL0.1μg组。造模后第十一天,鞘内给药,给药后两小时,动物新鲜取材,选取脊髓L4-L6节段,进行Western Blot实验。观察脊髓中p-ERK、p-p38、p-JNK、p-STAT3、SOCS1、 SOCS2和SOCS3表达变化。实验结果表明：1)与Naive组相比,在Cancer组p-ERK、 p-p38、p-JNK和p-STAT3表达上调,SOCS1、SOCS2和SOCS3表达无显著改变；2)与Cancer+NS组相比,给予ATL后p-ERK、p-p38和p-JNK的.上调被抑制,但p-STAT3表达无显著改变。3.3鞘内给予ATL抑制骨癌痛大鼠脊髓前强啡肽原mRNA上调将大鼠随机分成三组：Naive、Cancer+NS和Cancer+ATL0.1μg组。造模后第十一天,鞘内给药,给药后2小时,动物新鲜取材,选取脊髓L4-L6节段,采用高通量Real-Time PCR检测脊髓中前强啡肽原(Preprodynorphin,PPD)mRNA表达变化。结果显示：与Naive组相比,在Cancer+NS组,PPD mRNA的表达上调,给予ATL后可抑制其上调。3.4鞘内给予ATL抑制骨癌痛大鼠脊髓脂氧合酶5-L0和15-L0表达大鼠造模后随机分成五组：Naive、Sham、Cancer、Cancer+NS和Cancer+ATL0.1jμg组。造模后第十一天,鞘内给药,给药后两小时,动物新鲜取材,选取脊髓L4-L6节段,进行Western Blot实验。结果表明：1)与Naive组相比,在Cancer组大鼠脊髓脂氧合酶5-LO、12-LO和15-LO表达上调；2)与Cancer+NS组相比,给予ATL后,可抑制骨癌痛大鼠脊髓脂氧合酶5-LO和15-LO的表达,但是对12-LO的表达无显著影响。小结：在骨癌痛大鼠模型上,脊髓炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达增加；MAPK和STAT3信号通路磷酸化水平升高；脊髓前强啡肽原mRNA表达升高；脊髓脂氧合酶5-LO、12-LO和15-LO的表达增加。鞘内给予ATL可抑制骨癌痛大鼠脊髓炎性细胞因子IL-1p和TNF-αmRNA表达上调；抑制MAPK信号通路磷酸化；抑制脊髓前强啡肽原mRNA表达和脂氧合酶5-LO、5-LO表达。4.黄芩素对骨癌痛大鼠机械痛阈影响及相关机制研究4.1系统及鞘内给予黄芩素对正常大鼠机械痛阈无显著影响将大鼠随机分成四组：Naive+DMSO i.t、Naive+BE100μg/it、Naive+DMSO i.p.和Naive+BE300mg/kg/i.p组。在给药后0.5、1、2、3、4、6小时测痛。结果表明：与对照组相比,系统及鞘内给予黄芩素对正常大鼠机械痛阈无显著影响。4.2鞘内及系统给予黄芩素可提高骨癌痛大鼠机械痛阈4.2.1鞘内给予黄芩素可提高骨癌痛大鼠机械痛阈大鼠造模后随机分成四组：Cancer+DMSO、Cancer+BE10μg、Cancer+BE50μg和Cancer+BE100μg组。造模后第十一天,测痛后鞘内给药。在给药后0.5、1、2、3、4、6小时测痛。结果表明：鞘内给予100μg黄芩素可缓解骨癌痛,持续至给药后4小时。4.2.2系统给予黄芩素可提高骨癌痛大鼠机械痛阈大鼠造模后随机分成三组：Cancer+DMSO、Cancer+BE150mg/kg和Cancer+BE300mg/kg组。造模后第十一天,测痛后腹腔给药。在给药后0.5、1、2、3、4、6小时测痛。结果表明：在给药后两小时,给予300mg/kg黄芩素可缓解骨癌痛。4.3黄芩素提高骨癌痛大鼠机械痛阈的相关机制研究4.3.1鞘内给予黄芩素抑制骨癌痛大鼠脊髓炎性细胞因子表达将大鼠随机分成三组：Naive、Cancer+DMSO和Cancer+BE100μg组。造模后第十一天,鞘内给药,给药后两小时新鲜取材,选取脊髓L4-L6节段,用Real-Time PCR检测大鼠脊髓炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达变化。结果表明：与Naive组相比,在Cancer+DMSO组,脊髓IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达显著上调。给予黄芩素后可抑制IL-6和TNF-αmRNA表达上调。4.3.2鞘内给予黄芩素对骨癌痛大鼠脊髓相关信号通路的影响大鼠造模后随机分成两组：Cancer+DMSO和Cancer+BE100μg组：造模后第十一天,鞘内给药。给药后2小时,动物新鲜取材,选取脊髓L4-L6节段,用Western Blot技术检测大鼠脊髓磷酸化MAPK和STAT3信号通路表达变化。结果显示：与Cancer+DMSO组相比,给予黄芩素后可抑制p-p38和p-JNK的激活,但对p-ERK和p-STAT3表达无显著影响。4.3.3鞘内给予黄芩素抑制骨癌痛大鼠脊髓脂氧合酶5-LO的表达大鼠分组及干预同上,用Western Blot技术检测大鼠脊髓脂氧合酶5-LO、12-LO和15-LO表达变化。结果显示：与Cancer+DMSO组相比,给予黄芩素后可抑制脂氧合酶5-LO的表达,但对脂氧合酶12-LO和15-LO表达无显著影响。小结：在骨癌痛大鼠,鞘内及系统给予黄芩素可缓解骨癌痛,对正常大鼠机械痛阈无显著影响。在骨癌痛大鼠脊髓炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达上调；MAPK、STAT3信号通路磷酸化水平升高；脊髓脂氧合酶5-LO、12-LO和15-LO表达上调。鞘内给予黄芩素后,可抑制骨癌痛大鼠脊髓炎性细胞因子IL-1β和TNF-αmRNA表达上调,抑制p-p38和p-JNK的激活,抑制脂氧合酶5-LO表达上调。综上所述,本研究提示：1.鞘内给予脂氧素及其类似物可提高骨癌痛大鼠机械痛阈,并以ATL效果更好,对正常大鼠机械痛阈无显著影响；2.脂氧素受体在脊髓背角主要分布于星形胶质细胞,少量分布于神经元,与对照组相比在模型上受体的表达无显著改变；鞘内预先给予脂氧素受体拮抗剂BOC-2可阻断ATL缓解骨癌痛的作用,提示ATL发挥镇痛作用是通过与脂氧素受体结合；鞘内及系统给予不同剂量ATL均可缓解骨癌痛；3.鞘内给予ATL可抑制骨癌痛大鼠脊髓炎性细胞因子IL-1β和TNF-αmRNA的表达,抑制p-ERK、p-p38和p-JNK激活,抑制与中枢敏化密切相关的内阿片肽前强啡肽原mRNA表达,抑制脊髓脂氧合酶5-LO和12-LO表达。提示ATL可能是通过抑制这些炎性细胞因子表达、相关信号通路激活、强啡肽和脂氧合酶的表达参与缓解骨癌痛；4.鞘内及系统给予黄芩素可缓解骨癌痛,主要是通过抑制骨癌痛大鼠脊髓炎性细胞因子IL-6、 TNF-αmRNA表达,p-p38、p-JNK激活和脂氧合酶5-LO的上调。