论文摘要
甲氨蝶呤(MTX)临床主要用于小儿白血病、骨肉瘤、绒癌、乳腺癌等癌症的治疗，也可用于银屑病、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗。其不良反应包括骨髓抑制、黏膜溃疡和肾功能损伤等。MTX主要通过肾脏排泄，大部分药物以原型排出体外。MTX具有肾脏毒性，一旦引起肾脏损伤会进一步延缓排泄，使MTX清除延迟，继而发生更严重的毒副作用，甚至引起患者死亡。CPG2是一种细菌酶，能迅速的将MTX代谢为两个非活性代谢产物：谷氨酸和2，4-氨基-N-10-甲基碟酸(DAMPA)，DAMPA基本无毒性，且主要通过肝脏代谢，为临床上使用甲氨蝶呤的患者提供了一条非肾脏通道的排泄途径，降低大剂量MTX在临床使用时所面临的风险。化疗是肿瘤治疗的重要手段，提高化疗药物的剂量和暴露时间能够提高化疗药物的疗效，但同时化疗药物的毒副作用也随之提高。CPG2能够很好的降解MTX，减轻其毒副作用，但是CPG2降解MTX后会影响其抗肿瘤作用。如果能确定CPG2的一个合适的给药时间点和给药剂量，使MTX能最大程度的发挥抗肿瘤作用，同时又不会产生严重的毒副作用，这样就能够给予高剂量的MTX，提高MTX的抗肿瘤疗效，又能减轻MTX的毒副作用，故本研究的目的是观察CPG2在体内外对MTX抗肿瘤作用的影响，以确定CPG2的合理给药剂量和给药时间，使CPG2给药后即能有效降低MTX的毒性，又尽可能小的影响MTX的抗肿瘤效应，为两药在临床上的联合使用提供参考。在体外实验中，用MTT法，观察CPG2在体外对MTX抑制人乳腺癌MCF-7细胞和人绒毛膜癌JEG-3细胞作用的影响。在动物实验中，用未荷瘤的正常小鼠和裸鼠，观察了CPG2对500mg/kg或800mg/kg剂量下的MTX所致毒性的影响。用小鼠肉瘤S180和人乳腺癌MCF-7移植瘤模型，观察了CPG2对大剂量MTX（HDMTX）抗肿瘤活性和所致毒性的影响。抗肿瘤效应指标包括最大抑制率、瘤重抑制率、瘤体积抑制率和肿瘤分布图等；MTX毒性观察指标主要包括动物存活数量、体重变化、血清肌酐和尿素氮以及病理切片等。体外实验观察到，0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10μg/ml浓度的MTX作用2h后，对MCF-7和JEG-3细胞均具有良好的抑制作用，呈现浓度依赖性。随着作用时间的延长，低剂量的MTX也显示出较强的抑制作用。MTX暴露2小时后，加入终浓度为0.01、0.1、1、25、50和100U/ml的CPG2，MTX对MCF-7细胞的增生仍具有较强的抑制效应，呈现出良好的浓度依赖性，与MTX单独作用2h的效果相似，提示MTX作用于受试细胞2小时后，给予CPG2不能消除MTX已经产生的细胞杀伤效应，但是能阻值MTX的进一步作用；CPG2的剂量效应关系不明显，0.01和100U/ml产生的效果相似，说明CPG2降解MTX活性较强。在毒性试验中，观察到，对KM小鼠，500mg/kgMTX组，有4只死亡，体重最低值出现在给药后第7天，从第8天开始动物体重逐渐恢复；MTX+24hCPG2组有1只动物死亡，体重最低值出现在给药后第5天，从第6天开始动物体重逐渐恢复；MTX+12hCPG2组未出现动物死亡，动物体重基本没有下降。对裸鼠，800mg/kgMTX组有3只动物死亡，药后第7天体重开始恢复，但恢复较慢，实验结束时仍未完全恢复至给药前，MTX+12hCPG2组未出现裸鼠死亡，体重下降幅度较小，给药后3天开始恢复，给药后7天体重基本恢复至给药前，MTX+16hCPG2组有1只动物死亡，药后第5天裸鼠体重开始恢复，药后第8天体重基本恢复至给药前。对于S180移植瘤模型，第一次实验发现，500mg/kgMTX组的瘤重抑制率为58.5%，MTX给药后16h，给予400U/kgCPG2后瘤重抑制率下降到44.0%，给予100U/kgCPG2后瘤重抑制率为59.0%，与单用MTX类似。MTX组有4只小鼠死亡，小鼠体重下降较多，给予CPG2后，未出现动物死亡，给予CPG2剂量越大体重下降幅度越小，恢复也较快。重复实验也显示出类似结果，对人乳腺癌MCF-7移植瘤实验，800mg/kgMTX组的瘤重抑制率为32.4%，有4只动物死亡；MTX给药后12h，给予200U/kgCPG2，对瘤重抑制率影响较小，但仍有1只动物死亡；给予100U/kgCPG2后，瘤重抑制率37.6%，未出现动物死亡；给予50U/kgCPG2后，瘤重抑制率为45.5%，有1只动物死亡。给予不同剂量的CPG2后，裸鼠体重也出现一定的下降，但下降幅度较单用MTX组低，且恢复的速度也较快。每次实验结束时测量各组小鼠的血清肌酐和尿素氮，检测结果发现即使给予500-800mg/kg的MTX，小鼠未出现因使用HDMTX所引起的肾脏损伤，各组小鼠的血清肌酐和尿素氮并没有出现明显的变化，与未给予MTX的小鼠比较，没有出现统计学差别。肾脏病理切片也未发现明显的病理学变化。提示，给予HDMTX后，在小鼠体内出现HDMTX所致毒性机率较低。以上实验可以得出：在体外，MTX暴露2小时（含以上）可以对受试肿瘤细胞的生长有较强的抑制效应；CPG2能够消除MTX对体外癌细胞的生长抑制效应，但MTX暴露2小时后再合用，CPG2对MTX已经产生的抗癌效应基本没有影响。在体内，CPG2能很好的拮抗HDMTX在小鼠体内所致毒性，减少动物死亡数量，使动物体重更快恢复；CPG2给药时间应在MTX给药后12-16h，可以尽量避免HDMTX所致的毒性或动物死亡；CPG2的给药剂量在50-100U/kg时，对MTX抗肿瘤作用基本没有影响。