论文摘要
目的：低氧是实体瘤发生发展过程中存在的环境条件之一,是肿瘤发生恶性转化甚至转移的启动因子。同时,缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)与肿瘤的生长和发展密切相关,是近年来国内外抗肿瘤研究的一个重要的治疗靶点。3-(4-溴苯基)-2-(乙砜基)-6-甲基喹喔啉-1,4-二氧化物(Q39)是由替拉扎明(tirapazamine,TPZ)结构修饰得到的具有自主知识产权的全新化合物,可在低氧条件下诱导肿瘤细胞发生凋亡,因此对其低氧抗肿瘤作用进行研究,将有助于了解Q39乃至TPZ类似物发挥低氧诱导肿瘤凋亡的机制,为相关低氧抗肿瘤药物的研究和开发提供科学依据。本研究探索了Q39在低氧条件下诱导人白血病K562细胞和人肝癌Bel-7402细胞凋亡的作用机制。方法：1)MTT法测定Q39对人白血病K562细胞和肝癌Bel-7402细胞的增殖抑制作用,计算其半数抑制浓度(IC5o)。2)采用DAPI染色法观察K562细胞的凋亡情况。3)采用PI染色结合流式细胞术测定K562细胞和Bel-7402细胞的凋亡率。4)JC-1染色法观察Q39对K562细胞线粒体膜电位(△Ψm)的影响。5)采用Western blotting法检测低氧条件下细胞内procaspase-3、cleaved caspase-3、PARP、 Bax、Bcl-2、p-ERK、p-JNK、p-p38、VEGF和HIF-1α等蛋白表达的变化。6)采用免疫荧光法观察HIF-1α经Q39作用后的入核情况。结果：一、Q39在低氧条件下诱导人白血病K562细胞的凋亡的作用机制研究：1)Q39在低氧条件(3%O2)下能够明显抑制人白血病K562细胞的增殖,其IC50为(0.21±0.05)μmol/L。2)经DAPI染色证实,Q39作用6h后开始诱导K562细胞发生凋亡,后期细胞体积缩小,并出现凋亡小体。3)流式细胞术结果显示：20%02环境中K562细胞与Q39共孵育0、12、24和48h的凋亡率分别为5.5%、5.1%、4.6%和24.4%,而3%02环境中相应的诱导凋亡率分别达到了4.1%、34.5%、42.5和60.1%,表现出明显的时效依赖性及低氧选择性。4)JC-1染色实验结果显示：孵育0、6、12、24和48h后Q39使K562细胞的△中m呈明显下降趋势,并且具有时效依赖关系,提示Q39诱导K562的凋亡可能是通过线粒体信号转导通路实现。5) Western-blotting结果显示：Q39在低氧条件下降低K562细胞的HIF-1α、VEGF、procaspase-3和Bcl-2蛋白表达,显著增加Bax和cleaved caspase-3蛋白表达,并且促使PARP裂解。Q39显著下调了p-ERK和p-p38的表达水平,同时增加了p-JNK的表达,两者的调节具有时效依赖性。二、Q39在低氧条件下诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡的作用机制研究：1)Q39在低氧条件下抑制人肝癌Bel-7402细胞增殖,其ICso为(3.87±0.56) μmol/L。2)Q39在低氧条件下诱导Bel-7402细胞凋亡,5、10、20μmol/L的Q39引起的凋亡率分别为(27.1±4.8)%、(50.2±5.6)%和(62.5±6.2)%,其诱导凋亡作用呈浓度依赖性增加。3)随着低氧作用时间的延长,ERKl/2,JN和p38总蛋白水平变化不明显；而各自的磷酸化水平却呈现良好的时效依赖性,说明低氧条件激活MAPK通路表达。4)Q39在低氧条件下抑制人肝癌细胞Bel-7402的ERK1/2的磷酸化,但并不影响p38和JNK的磷酸化,说明Q39在低氧条件下发挥抗肿瘤活性时可能主要影响ERKl/2的活性。5)免疫荧光法证实在3%氧压环境下Q39作用16小时后能明显阻断低氧诱导的HIF-1α入核过程,影响其细胞核内外分布,减少具备活性的形成HIF-1α;同时Western blot法检测Q39(0-20μmol/L)作用后HIF-1α蛋白表达,结果发现Q39明显降低低氧激活的HIF-1α蛋白表达,说明Q39可能通过抑制ERK1/2磷酸化影响HIF-1α的转位,最终导致HIF-1α蛋白表达水平降低,从而引起细胞的凋亡。结论：Q39在低氧条件下对K562细胞和Bel-7402细胞具有较好的抑制作用,并能通过降低HIF-1α蛋白表达和调节其他凋亡相关蛋白表达诱导细胞凋亡。Q39诱导K562细胞凋亡可能是通过激活依赖于caspase级联反应的线粒体通路和低氧相关的HIF-1信号传导通路实现的。Q39诱导Bel-7402细胞凋亡可能通过调控ERKl/2信号通路,阻断HIF-1α入核过程,促进HIF-1α蛋白降解,减少HIF-1α蛋白合成。上述实验结果将有利于我们发现低氧条件下新的抗肿瘤药物作用靶点,对阻断和抑制HIF-1α介导的低氧肿瘤生长和恶性化提供新的思路。