论文摘要
研究目的通过研究季铵盐类药物对MthK钾离子通道的作用机制，阐明抑制剂对钾通道胞内侧的抑制方式和作用位点。MthK通道是一种来源于古生甲烷杆菌（Methanobacterium thermoautotrophicum）的钙激活配体门控的钾离子通道。虽然MthK的高分辨的晶体结构（1.45）已被视为钾离子通道的研究的结构模型，但MthK通道的药理学研究进展缓慢。揭示药物对MthK离子通道的作用机制，不仅对生命科学基础研究有很重要的推进作用，也对哺乳动物钾离子通道抑制剂的研究以及对临床研究药物机理的研究有一定的指导作用。季铵盐类药物（QAs）是一类经典的钾离子通道阻断剂，QAs可以抑制hERG通道、TREK-1、TASK、Shaker钾通道等[1,2,3]，其中TEA于2011年被美国FDA批准为治疗重症肌无力的药物。但是季铵盐类药物作用钾离子通道的药理机制和结合靶点仍然缺乏三维结构基础，在单通道机制方面的研究也不多[4-6]。因此本课题旨在通过三维结构分析和单通道电生理技术，阐明季铵盐类药物（QAs）对MthK钾离子通道的作用机理，填补这一领域的一些空白。探讨对MthK通道电流的抑制作用机制，对理解很多钾离子通道的抑制作用都有借鉴和指导作用。研究方法1、蛋白表达和纯化。采用基因工程技术对克隆的MthK基因进行定点突变，运用原核表达系统表达野生型MthK蛋白，使用FPLC纯化技术分离纯化野生型和突变体蛋白。2、合成不同分子侧链的季铵盐类药物。利用化学合成的方法，合成碳侧链疏水性递增的五种季铵盐类的四乙基铵（TEA）、四丙基铵（TPrA）、四丁基铵（TBA）、四戊基铵（TPeA）等季铵盐类药物。3、平面脂质双分子层实验。运用电生理平面脂质双分子层技术记录季铵盐类药物对MthK通道电流的影响。分析药物对MthK钾离子通道的作用机制。我们还针对E96位点的功能以及药理学意义进行了研究。实验结果1、季铵盐类药物对MthK钾离子通道都有明显的抑制作用。季铵盐侧链的疏水性与对MthK钾离子通道的抑制作用强弱呈正相关，随着分子体积和侧链延长，QA的抑制作用增强；而大于五个碳侧链或亲水基团侧链的季铵盐类药物对MthK的抑制强度则减弱。这说明：一、季铵盐类药物主要通过疏水作用抑制MthK通道。二、药物分子大小与作用位点的空间位阻影响其抑制作用。也即，药物分子偏离最适大小会降低抑制效果。2、季铵盐类药物通过两种作用方式抑制MthK通道。小分子侧链的季铵盐主要抑制MthK的电流幅度，不影响开放频率，而大分子侧链的季铵盐则降低其开放频率，不影响电流幅度。介于两者之间的季铵盐既抑制通道的电流幅度同时也抑制通道的开放频率。这提示存在两种作用方式：小分子侧链的季铵盐由于带较强的正电性，可能主要通过静电力作用于通道，它能快速的结合又能快速的解离，因此表现为电流幅度减小；而大分子侧链的季铵盐疏水性较强，可与孔道内部的疏水基团结合，通过空间位阻作用而阻塞通道。3、E96位点是MthK通道电流抑制剂作用的一个重要作用位点。突变体E96Q是将MthK通道上带负电荷的96位谷氨酸突变为中性电荷的谷氨酰胺，通过电生理测试发现：TEA主要抑制突变体E96Q通道的电流频率而不抑制通道的电流幅度，与TEA对野生型MthK的作用效果完全不同。说明E96位点可通过阴离子的静电作用与TEA相互作用，使TEA在胞内侧的孔道口实现快速的阻塞通道，又可快速的解离恢复通道活性。钙离子对突变体E96Q通道电流幅度抑制作用减弱，说明该位点对钙离子的抑制也有一定的作用。我们可以总结：MthK通道的E96位点是一个新发现的结合位点，对于很多带正电的抑制剂都会有一定的作用。实验结论季铵盐分子的大小直接影响对MthK通道的抑制强度。季铵盐在孔道内部通过疏水作用和静电作用共同作用抑制MthK钾通道。MthK通道的E96位点是TEA药物发挥抑制作用的一个重要位点。