论文摘要
芥子气（Sulfur Mustard，SM）是糜烂性毒剂的典型代表，接触可引起皮肤、眼睛、呼吸道等组织器官的急性损伤并遗留长期并发症。皮肤接触是芥子气中毒的重要途径，中毒早期病变包括红斑、水疱、紫癜，随着时间推移表现为色素沉着、皮肤干燥、瘙痒、脱屑和樱桃状血管瘤等，严重影响中毒者的生活质量。芥子气毒理机制复杂，目前尚无特效药问世。芥子气诱导的组织损伤与炎症反应关系密切。损伤区域聚集的大量中性粒细胞、单核细胞以及巨噬细胞等可释放髓过氧化物酶、炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、IL-8等，并诱导P物质、组织蛋白酶、纤溶酶原激活物、组胺等释放，导致组织红肿、水疱、坏死等病理损伤。芥子气诱导的炎症反应涉及多条信号通路，包括花生四烯酸代谢途径、丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、核转录因子-κB（Nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信号通路等。花生四烯酸可经环氧合酶和脂氧合酶催化产生前列腺素和白三烯。MAPK通路和NF-κB通路则可调节多种炎性介质的转录。以上述信号通路的关键信号分子为靶点的治疗药物研究一直是芥子气损伤防治药物研究的热点和重要方向。本研究针对芥子气引起炎性损伤的不同环节，选择了七大类抗炎和免疫抑制药物，评价了它们对芥子气所致皮肤损伤的保护作用，包括临床常用的传统抗炎药甾体与非甾体抗炎药，以及新型具有抗炎活性的药物辣椒素受体激动剂、p38抑制剂、程序性坏死抑制剂、免疫抑制类药物等，旨在明确不同种类抗炎药物的抗芥子气损伤活性及其药效特点。在此基础上，考察了以抗炎药物为基础的药物联用方案，为基于炎症反应的抗芥子气损伤药物研究提供了可靠的实验依据。目的考察不同类别抗炎/免疫抑制药物及以抗炎药物为基础的药物联用方案对芥子气所致皮肤损伤的保护作用。方法芥子气小鼠耳郭染毒模型的建立：采用32和128mg/mL芥子气5μL于雄性KM小鼠右耳内侧皮肤染毒，染毒24h、48h后，采用直径为8mm的打孔器取下耳郭标本，立即称重，计算肿胀率，将标本置于4%甲醛溶液中固定，制备病理切片，观察耳郭的组织病理学变化。芥子气全身中毒模型的建立：采用芥子气40mg/kg于雄性BalB/c小鼠皮下注射染毒建立芥子气全身中毒致死模型，每天给予相应药物，观察染毒7天内动物存活情况；芥子气染毒细胞损伤模型的建立：将人表皮角质形成细胞系HaCaT细胞于200、1000μM芥子气染毒30min后，PBS洗细胞一次，加入相应药物，继续培养6、24h，采用ATP法检测细胞活力，采用ELISA试剂盒测定细胞上清中IL-6和IL-8的含量；p38抑制剂系列化合物细胞水平筛选模型：采用1μg/mL LPS刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，加入相应药物后继续培养24h，采用AlphaLISA法检测培养上清中TNF-α含量，MTT法检测活细胞数；芥子气诱导p38和JNK激酶活化的时效关系考察： HaCaT细胞于200μM芥子气染毒30min后，PBS洗细胞一次，继续培养0、0.5、1、1.5、3、6、12、24h，采用Luminex技术检测细胞裂解液中p-p38、t-p38、p-JNK和t-JNK的表达；p38抑制剂对芥子气诱导p38和JNK激酶活化的影响： HaCaT细胞于200μM芥子气染毒30min后，PBS洗细胞一次，加入20μM SB203580或BIRB796继续培养0.5、12h，采用Luninex技术和Western Blotting检测细胞裂解液中p-p38、t-p38、p-JNK和t-JNK的表达。结果一、甾体与非甾体抗炎药物抗染毒皮肤损伤作用评价甾体和非甾体类抗炎药是目前临床使用最为广泛的抗炎药物，对多种病因所致的多种炎性疾病有良好的治疗效果。甾体类抗炎药通过调控靶基因的转录从而调节炎性介质的产生，而非甾体类抗炎药物主要通过抑制环氧合酶从而减少前列腺素的产生，降低机体炎症反应。本研究在建立不同损伤程度的芥子气耳郭皮肤染毒模型的基础上，选择甾体类抗炎药物代表药地塞米松和非甾体类抗炎药代表药吲哚美辛，考察了它们抗芥子气损伤作用的药效特点。1.不同剂量芥子气所致小鼠染毒耳郭皮肤损伤模型的建立芥子气所致皮肤损伤的严重程度与染毒剂量有关，染毒剂量越高，皮肤肿胀越明显。本研究采用文献中常用的32mg/mL芥子气5μL（低剂量）和在溶剂中达最大溶解度，即128mg/mL，5μL（高剂量）两个染毒剂量建立了不同损伤程度的芥子气小鼠耳郭染毒皮肤损伤模型，肿胀率分别为154.7%和204.8%。2.甾体类抗炎药地塞米松对芥子气耳郭染毒小鼠皮肤损伤的影响染毒前30min灌胃给予甾体类抗炎药物地塞米松（5mg/kg）对芥子气染毒小鼠耳郭肿胀无影响。3.非甾体类抗炎药吲哚美辛抗芥子气损伤的药效评价染毒前30min灌胃给予非甾体类抗炎药吲哚美辛（10mg/kg）对高、低剂量芥子气染毒小鼠耳郭肿胀均有显著地抑制作用，肿胀抑制率分别是40.0%和25.7%。二、新型具有抗炎活性药物抗芥子气损伤的药效评价芥子气致伤机制复杂，涉及多种炎性反应环节，因此本研究还进一步针对芥子气致炎的其它环节开展了研究。1.辣椒素受体激动剂抗芥子气损伤作用评价辣椒素受体激动剂可通过耗竭P物质抑制炎症反应，代表药物为奥伐尼。临床上用于减轻神经性炎症以及镇痛止痒等。目前仅有少量文献报道，其减轻芥子气所致皮肤损伤，但作用特点尚不明确。本研究以非甾体抗炎药吲哚美辛为阳性对照，考察了奥伐尼对染毒皮肤损伤的影响。结果表明，局部涂抹给予奥伐尼（0.125、0.25和0.05mg/耳）对低剂量芥子气染毒小鼠耳郭肿胀均有显著地抑制作用，且强于吲哚美辛，肿胀抑制率分别是68.2%、87.0%和81.6%；奥伐尼对高剂量芥子气染毒小鼠耳郭肿胀无明显影响。进一步采用伊红-苏木素染色，观察奥伐尼对低剂量芥子气染毒耳郭皮肤病理损伤的影响。结果表明，奥伐尼可显著降低芥子气诱导炎性细胞浸润和表皮细胞坏死，且保护作用强于吲哚美辛。2. p38抑制剂抗芥子气损伤活性筛选与评价p38激酶居于炎性反应的中央环节，其抑制剂是近年来抗炎免疫药理学研究的热点之一。BIRB796是第一个进入III期临床试验的p38抑制剂。本课题与化学合成实验室合作，获得了50个BIRB796类似物，并对它们的抗芥子气损伤活性进行了筛选和评价。2.1BIRB796类似物的抗炎活性初筛采用LPS诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞的体外模型，以p38抑制剂SB203580作为阳性对照，观察了50个化合物的抗炎活性。结果表明，化合物p38-98、p38-99、p38-123细胞毒性低，且可显著性抑制LPS诱导TNF-α分泌，IC50分别为10.33μM、48.92μM和19.39μM。2.1.1p38抑制剂抗芥子气损伤细胞水平药效评价2.1.1.1p38抑制剂对芥子气染毒HaCaT细胞活力的影响采用芥子气染毒HaCaT细胞模型，观察了p38抑制剂SB203580、BIRB796以及活性化合物p38-98、p38-99对染毒细胞的保护作用。结果表明，SB203580、BIRB796、p38-98、p38-99在染毒后6h时可显著改善200μM芥子气所致细胞活力的降低。2.1.1.2p38抑制剂对芥子气染毒HaCaT细胞IL-6和IL-8分泌的影响采用芥子气染毒HaCaT细胞模型，观察了p38抑制剂SB203580、BIRB796以及活性化合物p38-98、p38-99对染毒细胞炎性介质分泌的影响。结果表明，SB203580、BIRB796、p38-98、p38-99均可显著地抑制炎性细胞因子IL-6和趋化因子IL-8的分泌，并呈良好的剂量依赖关系。在两种p38抑制剂代表化合物中，BIRB796抑制作用强于SB203580。2.1.2p38抑制剂抗芥子气损伤整体动物水平药效评价2.1.2.1p38抑制剂对芥子气耳郭染毒小鼠皮肤损伤的影响染毒前24h、30min以及染毒后12h腹腔注射给予SB203580、BIRB796以及活性化合物p38-98、p38-99（10mg/kg），考察了上述p38抑制剂对染毒皮肤损伤的影响。结果表明，除SB203580外，BIRB796、p38-98、p38-99对耳肿胀均有一定的抑制趋势，抑制率分别是20.5%、17.4%和17.8%。2.1.2.2p38抑制剂对芥子气全身中毒小鼠存活的影响采用芥子气40mg/kg（LD99）进行皮下注射染毒建立芥子气全身中毒模型，静脉注射给予p38抑制剂SB203580、BIRB796以及活性化合物p38-98、p38-99（5mg/kg/d），观察小鼠染毒7天内的死亡情况。结果表明，模型组小鼠于染毒第5天全部死亡，药物处理组小鼠分别于染毒第6天和第7天全部死亡，提示p38抑制剂对全身中毒小鼠的存活率无明显影响2.1.2.3p38抑制剂中活性化合物代谢稳定性研究采用大鼠肝微粒体模型，对SB203580、BIRB796、p38-98、p38-99进行初步的代谢稳定性分析。结果表明，p38-98在大鼠肝微粒体中孵育60min后原型剩余量达到50%。提示p38-98具有较好的代谢稳定性。2.1.3SB203580和BIRB796抗芥子气损伤机制研究从药效评价结果可知，变构型p38抑制剂BIRB796对芥子气炎性损伤的保护作用强于竞争性p38抑制剂SB203580。本研究从对应激活化蛋白激酶（stress-activated proteinkinases，SAPKs）c-Jun氨基末端激酶（c-Jun Nterminal kinase，JNK）与p38活性的影响的角度，对SB203580和BIRB796的抗炎机制进行了考察。2.1.4芥子气诱导染毒HaCaT细胞p38和JNK激酶活化首先采用Luminex液相芯片技术，考察了芥子气对HaCaT细胞p38与JNK磷酸化的影响。结果表明，芥子气可迅速诱导p38和JNK激酶磷酸化水平升高，并在染毒后0.5h达到高峰。2.1.5p38抑制剂对SM诱导p38和JNK激酶活化的影响进而采用Luminex液相芯片技术和Western Blotting，检测SB203580和BIRB796对染毒HaCaT细胞p38和JNK激酶磷酸化的影响。结果表明，BIRB796可同时抑制芥子气诱导的p38和JNK激酶的磷酸化，而SB203580抑制p38激酶的磷酸化，却引起JNK激酶磷酸化程度升高。综上可知，p38抑制剂对染毒细胞模型有显著的保护作用，对染毒皮肤损伤有一定保护趋势。相比SB203580，BIIRB796保护作用更明显，这可能与BIRB796同时抑制芥子气诱导的p38和JNK磷酸化，而SB203580抑制p38却代偿性引起JNK磷酸化升高有关。3.程序性坏死抑制剂抗芥子气损伤作用评价程序性坏死是近年来发现的一种由死亡受体介导的caspases非依赖性细胞死亡模式，在凋亡被抑制的情况仍可介导细胞坏死，其在炎症性病变、缺血性心脑血管病、神经退行性疾病等多种疾病的发生发展及肿瘤细胞的耐药方面具有重要意义。DNA烷基化损伤可诱导细胞程序性坏死。而关于程序性坏死是否参与了芥子气诱导的细胞损伤目前尚无报道。本研究首次进行了程序性坏死抑制剂抗芥子气损伤作用的研究。3.1程序性坏死抑制剂对染毒HaCaT细胞存活的影响采用芥子气染毒HaCaT细胞模型，同时加入凋亡抑制剂z-VAD-fmk阻断细胞凋亡，观察程序性坏死抑制剂Nec-1对细胞存活的影响。结果表明，Nec-1、z-VAD-fmk单用时对芥子气所致HaCat细胞死亡具有明显保护作用，两者合用时对细胞的保护作用明显增强，细胞存活率接近100%。提示，程序性坏死参与芥子气诱导细胞死亡。3.2程序性坏死抑制剂对芥子气染毒小鼠耳郭肿胀的影响进一步，对程序性坏死抑制剂抗芥子气所致皮肤损伤的作用进行评价。结果表明，染毒前腹腔注射给予Nec-1（4mg/kg）和z-VAD-fmk（10mg/kg）对染毒耳肿胀均无明显影响。4.免疫抑制剂抗芥子气损伤的药效评价FTY720可通过降低外周血淋巴细胞数从而降低机体免疫反应，目前其治疗肾移植排斥反应已进入Ⅲ期临床研究阶段，对类风湿性关节炎模型的改善作用也已取得初步疗效。本研究采用小鼠芥子气耳郭皮肤染毒模型，考察了S1P抑制剂FTY720对芥子气染毒小鼠皮肤损伤的影响。结果表明，提前3天按1mg/kg/d连续灌胃给予FTY720对芥子气染毒小鼠耳郭肿胀无明显影响。5.中药制剂抗芥子气损伤的药效评价七叶皂苷钠具有抗炎抗渗出的作用，并可促进体内皮质醇类化合物的分泌。结果表明，七叶皂苷钠凝胶涂抹给药及腹腔注射给药（5mg/kg）对芥子气染毒小鼠耳郭肿胀均无明显影响。三、抗炎药物与其他药物合用抗芥子气损伤的药效评价芥子气损伤机制复杂，单一药物的疗效有限，因此，为提高治疗效果，需要针对不同的损伤机制采用联合用药和综合性治疗措施。聚(ADP-核糖)聚合酶（Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP）是目前外军认为最有前景的抗芥子气损伤的治疗靶点。本课题进一步考察了抗炎药物与PARP抑制剂合用对抗芥子气损伤的保护作用。1.吲哚美辛与PRAP抑制剂合用对小鼠耳郭染毒模型的影响染毒前给予非甾体抗炎药吲哚美辛（10mg/kg，po）和PARP抑制剂MUS003（200mg/kg，ip），考察两者合用对芥子气染毒皮肤损伤的影响。结果表明，低剂量芥子气染毒条件下，吲哚美辛组与两药合同组均可降低耳肿胀程度，抑制率分别为45.0%和19.1%。高剂量芥子气染毒条件下，MUS003、吲哚美辛及药物合用组均可降低耳肿胀程度，抑制率依次是21.8%、28.9%和32.4%。2.奥伐尼与PRAP抑制剂合用对小鼠耳郭染毒模型的影响染毒前给予辣椒素受体激动剂奥伐尼（0.5mg/耳，涂抹）与PARP抑制剂MUS003（200mg/kg，ip），考察两者合用对芥子气染毒皮肤损伤的影响。结果表明，低剂量芥子气染毒条件下，奥伐尼组与药物合同组均可降低耳肿胀程度，抑制率分别为56.9%和72.2%，且两药抑制耳肿胀具有显著地交互作用。在高剂量芥子气染毒条件下，MUS003组与合用组均可降低耳肿胀程度，抑制率为6.5%和28.3%。结论1.非甾体抗炎药吲哚美辛对低（32mg/mL）、高（128mg/mL）染毒剂量所致皮肤损伤具有较好的保护作用。辣椒素受体激动剂奥伐尼对低剂量芥子气所致皮肤损伤保护作用明显，优于吲哚美辛；2.非竞争性（变构型）p38抑制剂BIRB796对芥子气损伤的保护作用强于竞争性p38抑制剂SB203580，这可能与BIRB796同时抑制SM诱导的p38和JNK磷酸化，而SB203580抑制p38激酶同时代偿性地引起JNK激酶磷酸化程度升高有关；3.首次发现程序性坏死抑制剂可保护芥子气诱导的表皮细胞死亡，提示这一坏死机制参与了芥子气诱导的细胞死亡；4.基于抗炎药物的药物组合方案中，奥伐尼与PARP抑制剂MUS003合用对芥子气染毒小鼠皮肤损伤保护作用优于单用方案，可作为备选药物组合方案进行下一步研究。综上，本研究通过对基于炎症反应不同环节的多种类别的抗炎药物进行了抗芥子气损伤的药效评价，明确了各类药物对芥子气损伤的保护作用及其特点，并提出了基于抗炎药物的抗芥子气损伤组合用药方案，为基于炎性反应的抗芥子气新药研究提供了重要的理论依据和实验基础。